CAPÍTULO 1

ANEMIA FALCIFORME, BENEFÍCIOS DA TERAPIA E MECANISMOS DE AÇÃO DA HIDROXIURÉIA: REVISÃO DE LITERATURA

SICKLE CELL ANEMIA, THERAPY BENEFITS AND HYDROXYUREA ACTION MECHANISMS: LITERATURE REVIEW

DOI: https://doi.org/10.56001/22.9786500466386.01

Submetido em: 15/12/2021

Revisado em: 14/05/2022

Publicado em: 24/06/2022

Brisa Machado Pereira

Universidade Federal de Juiz de Fora, campus Governador Valadares, Curso de Farmácia, Governador Valadares- MG

http://lattes.cnpq.br/5106193858190172

Cibele Velloso-Rodrigues

Universidade Federal de Juiz de Fora, campus Governador Valadares, Departamento de Ciências Básicas da Vida, Governador Valadares-MG

http://lattes.cnpq.br/9434047652764467

Antônio Frederico de Freitas Gomides

Universidade Federal de Juiz de Fora, campus Governador Valadares, Departamento de Ciências Básicas da Vida, Governador Valadares-MG

http://lattes.cnpq.br/6242741828028741

Resumo

A doença falciforme (DF) é uma hemoglobinopatia hereditária responsável pela formação da hemoglobina S (HbS) em conjunto com outras hemoglobinas. A homozigose da variante S leva à anemia falciforme (AF), a forma clínica mais grave da DF. A falcização do eritrócito com consequente hemólise crônica acarreta inflamação exacerbada, crises dolorosas, vaso-oclusão, acidente vascular cerebral (AVC) e estresse oxidativo. Atualmente, a terapia medicamentosa aprovada no Brasil para tratamento da AF é a hidroxiureia (HU). Apresentar os benefícios da terapia e mecanismos de ação da HU no tratamento da AF. Para a elaboração desta revisão foram consultados artigos provenientes de estudos sobre a doença falciforme, com ênfase na AF, utilizando-se bases de dados de periódicos indexados. A principal ação da HU que implica em benefícios terapêuticos na AF é o aumento da produção da hemoglobina fetal (HbF). Também foi encontrado que a HU tem ações que levam a redução da inflamação e do estresse oxidativo via distintos mecanismos celulares e moleculares. Tais ações proporcionam diminuição do estresse oxidativo, das crises dolorosas e da ocorrência de AVC na AF. Variantes gênicas que afetam a produção de HbF parecem estar associadas à resposta a HU. O tratamento com HU em crianças e adolescentes traz benefícios como a diminuição de danos neurocognitivos, a redução na deficiência de crescimento e de vitamina D. São vários e inegáveis os benefícios observados no tratamento da DF com HU. Estudos que buscam esclarecer os mecanismos de ação da HU devem ser estimulados para aumentar a adesão e a segurança ao tratamento desde a primeira infância para que as morbidades da doença falciforme sejam drasticamente reduzidas ao longo da vida.

Palavras-Chave: Doença falciforme. Anemia falciforme. Hidroxiureia. Terapia.

Abstract

Sickle cell disease (SCD) is an inherited hemoglobinopathy responsible for the formation of hemoglobin S (HbS) together with other hemoglobin. Homozygosity of the S variant leads to sickle cell anemia (SCA), the most severe clinical form of SCD. Sickling of the red blood cell with consequent chronic hemolysis leads to exacerbated inflammation, painful crises, vaso-occlusion, stroke, and oxidative stress. Currently, the drug therapy approved for the treatment of SCD in Brazil is hydroxyurea (HU). To present the benefits of HU therapy and its mechanisms of action in the treatment of SCA. Articles from studies of sickle cell disease, with emphasis on SCA, were consulted for the elaboration of this review, using databases of indexed journals. The main action of HU that implies therapeutic benefits in SCA is the increased production of fetal hemoglobin (HbF). It was also found that HU has actions that lead to the reduction of inflammation and oxidative stress via distinct cellular and molecular mechanisms. Such actions provide a decrease in oxidative stress, pain crises, and stroke occurrence in SCA. Gene variants that affect HbF production seem to be associated with the response to HU. Treatment with HU in children and adolescents brings benefits such as decreased neurocognitive damage, reduced growth, and vitamin D deficiency. There are several and undeniable benefits observed in the treatment of DF with HU. Studies seeking to clarify the mechanisms of action of HU should be encouraged to increase adherence and safety to treatment from early childhood so that sickle cell disease morbidities are drastically reduced throughout life.

Key words: Sickle cell disease. Sickle cell anemia. Hydroxyurea. Therapy.

Introdução

A doença falciforme (DF) é considerada umas das enfermidades hereditárias mais comuns do mundo, responsável pela formação da hemoglobina S (HbS), em conjunto com outras hemoglobinas. A variante genética do gene HBB que determina a HbS quando em homozigose determina a anemia falciforme (AF), forma mais grave e mais estudada dentre o conjunto de doenças falciformes (KATO et al., 2018; WARE et al., 2017; TELEN, 2016).

Na AF, alterações estruturais da hemácia em decorrência da baixa oxigenação da hemoglobina levará a mudanças nas suas propriedades físico-químicas. O processo inicial dessas alterações é conhecido como polimerização, que acontece pela união de várias moléculas de HbS à medida que a concentração de O₂ dentro da hemácia diminui, fazendo que estas assumam um formato falciforme rígido (MCGANN; WARE, 2015; WILLIAMS; THEIN, 2018) com a formação de polímeros de desoxihemoglobina (BRASIL – MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015). A polimerização vai acarretar uma série de eventos relacionados a hemólise excessiva, tais como: anemia severa, infecções recorrentes, crises de dor, icterícia, acidente vascular cerebral (AVC), síndrome torácica aguda e priapismo. Todas essas manifestações clínicas são o resultado da hemólise crônica, inflamação exacerbada e vaso-oclusão (TELEN, 2016; KUYPERS, 2014).

Atualmente, os tratamentos disponíveis para pacientes com AF incluem a transfusão sanguínea, o transplante de medula óssea (TMO) e o uso da hidroxiureia (HU).  A transfusão sanguínea a longo prazo pode causar hiperviscosidade, sobrecarga de volume, reações alérgicas, sobrecarga de ferro, e infecção por hepatite B, hepatite C, infecção pelo vírus do HIV e outros agentes. O transplante de medula óssea requer um doador compatível e ainda traz o risco de complicações durante a cirurgia (BUCHANAN et al, 2004; SILVA; SHIMAUT, 2006).

Diante de todos os embaraços decorrentes da transfusão sanguínea e do TMO, por ser segura, acessível e economicamente viável, a terapia com HU tem ganhado cada dia mais espaço devido aos benefícios no tratamento da DF, acarretando melhoria no quadro clínico e na qualidade de vida dos pacientes (WARE; DERTINGER, 2021; KARKOSKA et al., 2021; QUINN et al., 2021; SCHUCHARD et al., 2019; TSHILOLO et al., 2018; RODRIGUEZ et al., 2018). Baseado nessas evidências, foi realizada uma busca e análise em bases de dados de periódicos para produção desta revisão, com foco nos benefícios e mecanismos de ação da HU no tratamento da doença falciforme.

Metodologia

Trata-se de uma revisão de literatura integrativa de caráter exploratório realizada com buscas em artigos científicos datados de 2004 a 2021, obtidos em diferentes bases de dados: Scielo, BVS (Biblioteca Virtual de Saúde), Google Acadêmico, PubMed, Periódicos Capes e Manuais do Ministério da saúde e da Agência de Vigilância Sanitária, utilizando a seguinte combinação de descritores em português e inglês: “Doença falciforme” (sickle cell disease), “Anemia falciforme” (sickle cell anemia) e “Hidroxiureia” (Hydroxyurea).

A pesquisa literária foi realizada no segundo semestre de 2021. Foram incluídos 46 artigos completos, sendo que 30 artigos foram publicados nos últimos cinco anos, com dados condizentes referentes aos aspectos fisiopatológicos da DF com ênfase na AF e os benefícios da terapia com HU, bem como os mecanismos de ação deste fármaco. Foram excluídos da pesquisa artigos de opinião, cartas ao editor e comunicações breve, além, daqueles que divergiam do objetivo proposto na presente revisão.

Resultados e Discussão

• Aspectos fisiopatológicos da doença falciforme

Um dos sintomas mais evidentes na DF ocorre devido a hemólise acentuada e liberação de dímeros de hemoglobina no plasma. Estes dímeros podem se ligar a haptoglobina formando um complexo que é reconhecido pelo receptor CD163 (grupo de diferenciação 163) de macrófagos e monócitos. Após o reconhecimento, o complexo é endocitado e degradado no interior dessas células. Outros dímeros sofrem oxidação no plasma liberando o ferro-heme que se complexa à hemopexina. Este complexo será posteriormente degradado no fígado. A hemólise excessiva também liberará no plasma a arginase, uma enzima eritrocítica que degrada L-arginina, um substrato da enzima óxido nítrico sintase (eNOS), em L-citrulina e óxido nítrico (NO). Como a degradação da L-arginina, a sua conversão em L-citrulina e NO fica comprometida, ocorrendo diminuição do NO disponível no meio endotelial, causando disfunções das células endoteliais, efeitos pró-inflamatórios e estresse oxidativo. A diminuição de NO também atuará na via de formação da cGMP, que por sua vez é importante para regulação do tônus do músculo liso, causando distonia muscular, constrição vascular; hipertensão pulmonar e sistêmica, disfunção erétil, contrações gastrintestinais, disfagia e dores abdominais. A diminuição dos níveis de cGMP através do esgotamento do NO também poderá levar à ativação e agregação de plaquetas, promovendo a formação de coágulos (ROTHER et al., 2005).

Ainda devido a diminuição do NO disponível, pode ocorrer a aderência de hemácias falcizadas ao endotélio vascular, através da ligação do VLA-4 (antígeno de ativação tardia-4) presente na membrana hemácias com a fibronectina, a VCAM-1 (molécula de adesão celular-vascular-1) e o Lu/BCAM [grupo sanguíneo Luterano (Lu)/antígenos molecular de adesão de células basais (BCAM)] presentes na membrana do endotélio vascular. Pode ocorrer também a lateralidade lipídica alterada (exposição da fosfatidilserina) na monocamada externa da membrana da hemácia falciforme contribuindo para sua adesão ao endotélio, além da hemólise e consequente vaso-oclusão. Além disso, danos oxidativos nas proteínas de membrana da hemácia contribuem para deformar ainda mais sua estrutura. Outros ligantes conhecidos como CD36 (grupo de diferenciação 36) e CD37 (grupo de diferenciação 37), presentes na membrana da hemácia falcizada e na membrana do endotélio, ligam-se a trombospondina-1 (TSP). O eritrócito falciforme vai se ligar via ICAM-4 (molécula de adesão intercelular-4) à plaqueta ativada pelo receptor a2β3. A exposição de α2β3 na superfície plaquetária ocorre após a estimulação causada pela ligação da trombospondina 1 ao CD47 (grupo de diferenciação 47) endotelial. O mesmo α2β3 da plaqueta também pode ligar-se ao ICAM-1 (molécula de adesão intercelular endotelial-1) via fibrinogênio (Fg). Além disso, os reticulócitos ligam-se ao endotélio através da ligação VLA-4 com fibronectina e VCAM-1 ou ICAM-4 com CD36. Através do CD11 ou CD18 (grupo de diferenciação 11 ou 18 respectivamente) presentes na membrana neutrófilo este também se ligará ao reticulócito via ICAM-4. Em conjunto, esses eventos são responsáveis pela maioria dos sintomas observados na AF (GARNIER et al., 2020; PICCIN et al., 2019; TELEN, 2016)

• Histórico do uso da hidroxiureia e seus mecanismos de ação

A hidroxiureia ou hidroxicarbamida foi inicialmente utilizada como agente quimioterápico no tratamento do câncer, atuando na fase S do ciclo celular como um agente antiproliferativo com função de citorredução e atividade antimetabólica, inibindo a ribonucleotídeo redutase, causando assim uma depleção do pool de desoxirribonucleotídeos, reduzindo drasticamente a proliferação celular e o câncer (KAPOR et al, 2021).

Atualmente a HU é o único medicamento aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) nos Estados Unidos e pelo Ministério da Saúde (MS) no Brasil para o tratamento da DF. A descoberta da sua eficácia para o tratamento da DF surgiu a mais de 35 anos e vem ao longo do tempo demonstrando sua capacidade de reduzir quase todas as complicações agudas e crônicas da doença (WALKER; OFORI-ACQUAH, 2015).

A HU é administrada diariamente a pacientes com AF por via oral na forma de cápsulas, comprimidos solúveis ou líquido. Sua dose inicial é de 25 mg/kg e aumenta para dose máxima tolerada (DMT), podendo apresentar variações na dosagem de acordo com a prescrição médica (KARKOSKA; MCGANN, 2021).

A HU é prontamente absorvida após administração oral. Picos de níveis plasmáticos são alcançados em uma a quatro horas após uma dose oral. Com doses aumentadas, são observados picos médios de concentrações plasmáticas. A HU distribui-se rápida e extensamente pelo organismo, apresentando um volume de distribuição estimado aproximando-se ao da água corporal total. A HU concentra-se nos leucócitos e eritrócitos e atravessa a barreira hematoencefálica. Até 50% da dose oral sofre conversão através de vias metabólicas que não estão totalmente caracterizadas. Uma delas é provavelmente o metabolismo hepático saturável. Outra via menor pode ser a degradação a ácido acetohidroxâmico pela urease encontrada nas bactérias intestinais. A excreção da HU em humanos provavelmente é um processo linear renal de primeira ordem. Em pacientes com malignidades, a eliminação renal varia de 30 a 55% da dose administrada (ANVISA, 2021).

Os mecanismos de ação da HU no tratamento da AF ainda não foram totalmente esclarecidos. Seus efeitos terapêuticos incluem a melhora nos parâmetros avaliados no hemograma completo, aumento da contagem de reticulócitos, aumento da sobrevida e reologia das hemácias com redução da hemólise através da indução da produção da Hemoglobina fetal (HbF) e L-glutamina no eritrócito, diminuição da concentração de HbS e diminuição de células falcizadas, com consequentemente redução da vaso-oclusão, diminuição do estresse oxidativo e do estresse metabólico cerebral, diminuição da ocorrência de AVC e da ativação do sistema do complemento (KARKOSKA; MCGANN, 2021, ROUMENINA et al., 2020; FIELDS et al., 2019; PICCIN et al., 2019; PECKER et al., 2017; LUCHTMAN-JONES et al., 2016; SUMMARELL; SHEEHAN, 2016).

Evidências apontam que o aumento da produção de HbF seja um dos fatores chave no tratamento da AF. Acredita-se que o aumento de metabólitos do NO plasmático está correlacionado com o aumento da concentração de cGMP (guanosina 3,5-monofosfato ciclíca) mediada pela sGC (guanilil ciclase solúvel). O NO se liga diretamente ao grupo desoxi-heme ferroso da enzima, gerando o complexo ferro-nitrosil, ativando a via sGC/cGMP promovendo o efeito vasodilatador no endotélio. Outro mecanismo proposto para o aumento de NO intravascular e intracelular ocorre pela interação da HU com oxihemoglobina e desoxihemoglobina com oxidação destas em metemoglobina (metHb). A HU poderá ainda interagir com outras moléculas de hemoglobina presentes e formar o complexo nitrosil-hemoglobina (HbNO), liberando lentamente o NO da ligação com a hemoglobina, aumentando assim seus níveis intracelulares. A HU pode também se decompor quimicamente ou enzimaticamente (pela ação da peroxidase, urease ou catalase) e produzir grupos NO, aumentando sua concentração intravascular (CONRAN; TORRES, 2019; KING, 2004; COKIC et al., 2006).

Acredita-se também que ativação via sGC/cGMP pela HU induza a expressão do gene da g-globina (HBG1) da HbF em eritrócitos e suas linhagens de células primárias, ocorrendo uma diminuição drástica dos eventos envolvidos na falcização, pela promoção da hidratação das hemácias, evitando a deformabilidade e consequentemente a diminuição da taxa de hemólise e de leucócitos circulantes, diminuindo assim, a inflamação endotelial e as crises vaso-oclusivas. A HU promove também o aumento do volume corpuscular médio (VCM) e como consequência são observadas hemácias maiores, gerando uma melhora em sua reologia (RENÓ et al., 2020; MCGANN; WARE, 2015; SUMMARELL; SHEEHAN, 2016; PECKER et al., 2017). O aumento da produção de HbF pela HU, mantém a distribuição de HbF nos eritrócitos (conhecidos também como células F). Uma porcentagem de HbF igual a 30%, que corresponde a uma distribuição de HbF quase pancelular nos eritrócitos variando de 70% a 80% de células F, pode prevenir a polimerização de HbS e falcização das hemácias, reduzindo a frequência e intensidade da maioria das complicações da AF (QUINN et al., 2021; STEINBERG, 2014).

Outro mecanismo proposto pela ação da HU é a diminuição da produção da VCAM-1 pelo endotélio, com consequente diminuição da adesão de hemácias falcizadas e reticulócitos ao endotélio vascular. Isso facilita a recaptação de cálcio para os estoques intracelulares das células endoteliais, via bomba de Ca²⁺, abrindo canais de K⁺ e fechando canais de Na⁺, resultando em um relaxamento do vaso. Outro mecanismo desencadeado pela HU ocorre através indução da fosforilação e ativação da enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), uma enzima responsável pela produção de NO no endotélio vascular, que ativada causará vasodilatação (SUBOTIČKI et al., 2021). Este efeito é modulado por um aumento dos níveis intracelulares da cAMP (adenosina 3′,5′-monofosfato cíclico) que estimula a fosforilação da Ser1177 (um resíduo de serina que é considerado um sítio de ativação da eNOS) pela PKA (proteína cinase A). O aumento da atividade da eNOS também leva a aumentos de cGMP em células endoteliais, que implicarão no relaxamento do endotélio (COKIC et al., 2006).

Sabe-se que na AF a hipóxia/reperfusão levam à ativação de vias inflamatórias envolvendo leucócitos mononucleares, polimorfonucleares e plaquetas. (TELEN, 2016).

Para avaliar os efeitos anti-inflamatórios da HU em indivíduos com AF, Garnier et al. (2020) coletaram e purificaram MPs (micropartículas de vesículas extracelulares submicrônicas) que expõem em sua superfície a PS (fosfatidilserina). Estas MPs são comumente encontradas em alta concentração na AF. Foram obtidas MPs de participantes com AF antes e dois anos após o início do tratamento com HU e MPs durante uma crise vaso-oclusiva e após recuperação desse evento. Observaram-se aumento do mRNA de ICAM-1 e da proteína ICAM-1 (responsável pela adesão de neutrófilos ao endotélio vascular) nos participantes com AF comparados aos voluntários saudáveis. A superexpressão de ICAM-1 foi causada principalmente por MPs derivadas de eritrócitos da AF. MPs dos participantes com AF tratados com HU diminuíram os efeitos pró-inflamatórios em células endoteliais em comparação com MPs coletados antes da terapia com HU. Os MPs liberados durante a crise vaso-oclusiva aumentaram os níveis de ICAM-1, de maneira dependente de PS, em comparação com os MPs coletados de participantes recuperados da crise vaso-oclusiva. Os autores concluíram que os MPs desempenham um papel fundamental na fisiopatologia da AF desencadeando um efeito pró-inflamatório de células endoteliais e que o tratamento com HU reduz a exposição de PS em MPs, o que anula suas propriedades pró-inflamatórias.

A HU também contribuí para a modulação da atividade do sistema antioxidante, diminuindo marcadores inflamatórios e estabilizando a integridade da membrana eritrocitária (LANARO, 2009). Individuos com DF estão sujeitos a uma carga excessiva de estresse oxidativo e uma baixa disponibilidade de NO, oriundos dos processos de hemólise crônica (que liberará hemoglobina e arginase no plasma), além da vaso-oclusão proveniente do aumento da exposição de moléculas de adesão em eritrócitos e plaquetas com consequente adesão ao endotélio vascular (TAYLOR et al., 2008).

Renó et al. (2020) realizaram quantificação lipídica e avaliaram parâmetros do estresse oxidativo em eritrócitos de indivíduos saudáveis (controle) e de pacientes com AF tratados e não tratados com HU. Os eritrócitos de indivíduos com AF, independente do tratamento com HU, apresentaram aumento do estresse oxidativo em relação ao grupo controle, incluindo TBARS (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico), teor de Fe³⁺ (o nível de Fe³⁺ é um indicador indireto de espécies reativas de oxigênio – ROS) e fragilidade osmótica e diminuição do colesterol total. Observou-se que o tratamento da AF com HU aumentou o teor de Fe³⁺ e atividade da GSH-Px e diminuiu a atividade da glutationa redutase (GR), dos níveis de glutationa, de colesterol total e do conteúdo de fosfolipídios.

Em um estudo exploratório marcadores de estresse foram medidos em amostras de plasma para investigar o estresse oxidativo sistêmico na AF e o impacto potencial da terapia com HU. A terapia com HU foi associada a uma diminuição do estresse oxidativo com valores mais baixos de sCD14 (grupo de diferenciação 14 solúvel – com efeito anti-inflamatório sistêmico), GSH e superóxido dismutase (SOD) na AF, reforçando a ideia de que a doença está associada a uma desregulação substancial das respostas oxidativas e que estas podem ser atenuadas pelo tratamento com HU (VINHAES et al., 2020)

Outro estudo investigou a viabilidade celular, juntamente com marcadores inflamatórios e oxidativos em neutrófilos de indivíduos com AF e os efeitos da terapia HU sobre essas células, avaliando a responsividade à dose. Os autores demonstraram que os neutrófilos de participantes não tratados com HU apresentaram fragilidade da membrana e diminuição significativa da viabilidade celular. Os níveis de marcadores inflamatórios; mieloperoxidase (MPO), fator de necrose tumoral alfa (TNF-a), interleucina 10 (IL-10) e oxidativos; SOD, GSH-Px e malonaldeído (MDA) foram alterados nas células dos participantes com AF não tratados com HU. O tratamento com HU reverteu os níveis de todos os marcadores para concentrações semelhantes às de indivíduos saudáveis com uma relação dose-efeito positiva (PEDROSA; LEAL; LEMES, 2020).

Um estudo recente realizado por Roumenina et al. (2020) sobre a ação HU na modulação da resposta do sistema de complemento, avaliou se a droga evita danos aos tecidos de indivíduos com AF. Foi mostrado que a concentração plasmática do sistema de ataque a membrana (sC5b-9), um marcador para a ativação terminal do complemento, está aumentada em 61% no plasma dos participantes com AF não tratados com HU. Demonstrou ainda que a maior ativação do complemento in vitro foi promovida pelos eritrócitos de indivíduos com AF não tratados com HU. Além disso, foi observado que ativação do complemento está positivamente correlacionada com a porcentagem de células falciformes densas (DRBCs). Os autores concluíram que a hiperativação do complemento é um evento patogênico comum na AF que está associado à formação de DRBCs e hemólise, afetando hemácias, leucócitos e células endoteliais e que a ativação do complemento é parcialmente inibida nos pacientes tratados com HU.

Estudos genômicos também vêm demonstrando os mecanismos de ação da HU no tratamento da AF. De acordo com Zhu et al. (2017) a HU reativa o gene γ-globina fetal para aumentar a produção de HbF. Para determinar estes possíveis mecanismos de ação, foram quantificados em eritroblastos cultivados a partir de células CD34⁺ do sangue periférico de pacientes com AF o mRNA e os reguladores da transcrição NF-Y, GATA-1, GATA-2, BCL11A, TR4, MYB e NF-E4 que montam o complexo promotor γ-globina e regulam a transcrição deste gene. Com base nas alterações observadas nos níveis de expressão dos genes dos reguladores da transcrição GATA-1, GATA-2 e BCL11A os autores calcularam o Índice de Capacidade de Resposta à Hidroxiureia (IndexHU-3), que se correlacionou fortemente com os níveis de HbF no sangue periférico, sendo este considerado um forte indicador de responsividade da HU em portadores de AF.

Em um estudo genômico associado às respostas da HU no aumento da produção de HbF em indivíduos com AF, tratados prospectivamente com aumento da dose de HU até atingir a DMT, identificaram-se importantes marcadores genéticos de baixa resposta ao tratamento com HU. Três novos loci gênicos, PTPRD, RPH3AL e ELL2, apresentaram variantes de nucleotídeo único (SNVs) associadas a respostas de HbF. O PTPRD é um gene que codifica o receptor de proteína tirosina fosfatase envolvido em processos celulares, como crescimento e diferenciação celular, enquanto RPH3AL codifica uma proteína semelhante à rabfilina 3A, conhecida por estar envolvida na exocitose íon cálcio dependente. O ELL2 codifica um fator de alongamento para a RNA polimerase II e pode modificar o processamento do mRNA sob os efeitos citostáticos da HU. Pacientes que possuíam essas variantes genéticas apresentaram níveis mais baixos de HbF relacionada a DMT de HU (MARAHATTA et al., 2020).

Em outro estudo genômico realizado por Ware et al. (2011) projetado para fornecer dados da farmacocinética de primeira dose (PK) de HU ministrada em indivíduos com AF, investigaram-se parâmetros de farmacodinâmica (PD), incluindo resposta do aumento da HbF até a DMT. Nos participantes do estudo de PK, foi observada variabilidade substancial interpaciente, além de um novo fenótipo de absorção oral (rápida ou lenta) que influenciou os níveis séricos de HU e a exposição a DMT. As respostas de PD em foram robustas e semelhantes a outros estudos. A análise farmacogenética mostrou que polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) influencian os níveis basais de HbF, incluindo cinco variantes no gene BCL11A, mas nenhum influenciando DMT e percentual de HbF ou dose dependente. Os autores demonstraram que a HU aumenta a HbF em níveis que variam de 10% a 40%, verificando que essa variabilidade interpaciente é alta, sendo que a própria DMT é variável, e prognósticos precisos de respostas da HU não existem atualmente.

Recentemente tem-se discutido o uso da HU em crianças com AF, avaliando sua eficácia, dose/efeito, bem como a idade ideal para o início da administração. A terapia com HU, vêm demonstrando eficácia laboratorial e clínica quando administrada na DMT em crianças com AF, demonstrando que o tratamento precoce com HU não apresenta toxicidade, possui baixo risco carcinogênico, sendo, portanto, seguro, viável e altamente eficaz na prevenção de complicações da AF, incluindo episódios de dor, síndrome torácica aguda complicada, vaso-oclusão e AVC. Tem sido observado também diminuição da hipoxemia persistente, do estresse oxidativo, de danos neurocognitivos e  redução da deficiência no crescimento e de vitamina D e (HEITZER et al., 2021; KARKOSKA et al., 2021; QUINN et al., 2021; MARAHATTA, et al., 2020; VINHAES et al., 2020; SCHUCHARD et al., 2019; THOMAS et al., 2019; VAN GEYZEL et al., 2019; TSHILOLO et al., 2018; ADEGOKE et al., 2017; ESTEPP et al., 2017; PHILLIPS et al., 2017; WARE et al., 2011).

A decisão de prescrever HU não é estática e requer monitoramento contínuo cuidadoso tanto da adesão do tratamento, da idade de início, bem como da dose para otimizar o efeito. Assim, cabe aos médicos avaliarem os padrões hematológicos de rotina de cada paciente a fim de prescrever a dose ideal de HU (QUINN et al., 2021; STEINBERG, 2014). 

Os estudos elencados na presente revisão indicam que a prescrição médica precoce e universal da HU tanto para crianças quanto para adultos com AF que ainda não iniciaram a terapia é o padrão de atendimento, demonstrando que os benefícios do uso da HU vão além dos seus efeitos adversos. Um compromisso cuidadoso e deliberado para seguir na prática clínica o uso da HU é viável e necessário, pois resulta em melhorias mensuráveis ​​nos resultados clínicos dos pacientes com AF.

­­Considerações Finais

Diante dos achados disponíveis na literatura, fica evidente a importância da terapia com HU no tratamento de portadores da AF evidenciada pelo aumento na sobrevida das hemácias, aumento do VCM, aumento da produção de NO, diminuição do estresse oxidativo, diminuição das crises dolorosas como a síndrome torácica aguda e a prevenção da ocorrência de AVC. Além da diminuição dos danos neurocognitivos, da deficiência no crescimento e de vitamina D em crianças. Todos os benefícios observados no tratamento da AF com HU melhoram a qualidade de vida dos pacientes. Estudos envolvendo a HU devem ser estimulados para aumentar a segurança e a adesão ao tratamento com consequente redução na morbidade da doença na nossa população.

Agradecimentos

Para realização da presente revisão agradecemos o apoio do Programa de Iniciação Científica da Pró-Reitoria de Pós-graduação e Pesquisa da Universidade Federal de Juiz de Fora (Edital XXXIII BIC/UFJF – 2020/2021).

Referências

ADEGOKE, S. A. et al. Impact of Hydroxyurea on Anthropometry and Serum 25-Hydroxyvitamin D Among Children With Sickle Cell Disease. Journal of Pediatric Hematology/Oncology, v. 40, n. 4, p. e243-e247, 2017.

ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Hidroxiureia EMS S/A, 2021, Disponível em: https://consultas.anvisa.gov.br/#/medicamentos/q/?nomeProduto= Hidroxiureia. Acesso em: 20 de out. 2021.

BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção à Saúde. Departamento de Atenção Hospitalar e de Urgência. Doença falciforme: diretrizes básicas da linha de cuidado / Ministério da Saúde, Secretaria de Atenção à Saúde, Departamento de Atenção Especializada e Temática. Brasília, 2015.

BUCHANAN, G. R. et al. Sickle Cell Disease. American society of Hematology, v. 2004, n. 1, p. 35-47, 2004.

COKIC, V. P. et al. Hydroxyurea induces the eNOS-cGMP pathway in endothelial cells. Blood, v. 108, n. 1, p. 184-191, 2006.

CONRAN, N.; TORRES, L. cGMP modulation therapeutics for sickle cell disease. Experimental Biology and Medicine, v. 244, p. 132-146, 2019.

ESTEPP, J. H. et al. A clinically meaningful fetal hemoglobin threshold for children with sickle cell anemia during hydroxyurea therapy. American Journal of Hematology, v. 92, n. 12, p. 1333–1339, 2017.

FIELDS, M. E. et al. Hydroxyurea reduces cerebral metabolic stress in patients with sickle cell anemia. Blood, v. 133, n. 122, p. 2436-2434, 2019.

GARNIER, Y. et al. Plasma microparticles of sickle patients during crisis or taking hydroxyurea modify endothelium inflammatory properties. Blood, v. 136, n. 2, p. 247-256, 2020.

HEITZER, A. M. et al. Hydroxyurea treatment and neurocognitive functioning in sickle cell disease from school age to young adulthood. British Journal of Haematology, v. 195, p, 256-266, 2021.

KATO GJ, et al. Sickle cell disease. Nature Reviews Disease Primers, v. 4, n. 18010, p. 1-22, 2018.

KAPOR, S, et al. Mechanisms of Hydroxyurea-Induced Cellular Senescence: An Oxidative Stress Connection? Oxidative Medicine and Cellular Longevity, v. 2021, p. 1-17, 2021.

KARKOSKA, K. et al. Implementation of near-universal hydroxyurea uptake among children with sickle cell anemia: A single-center experience. Pediatric Blood & Cancer, v. 68, e29008, 2021.

KARKOSKA, K.; MCGANN, P.T. How I approach disease-modifying therapy in children with sickle cell disease in an era of novel therapies. Pediatric Blood & Cancer, v. 68, e29363, 2021.

KING, S. B. Nitric Oxide Production From Hydroxyurea. Free Radical Biology & Medicine, v. 37, n. 6, p. 737-744, 2004.

KUYPERS, F. A. Hemoglobin S Polymerization and Red Cell Membrane Changes. Hematology/Oncology Clinics of North America, v. 28, n. 2, p. 155-179, 2014. 

LANARO, C. et al. Altered levels of cytokines and inflammatory mediators in plasma and leukocytes of sickle cell anemia patients and effects of hydroxyurea therapy. Journal of Leukocyte Biology, v. 85, p. 235-242, 2009.

LUCHTMAN-JONES, L. et al. Effects of hydroxyurea treatment for patients with hemoglobin SC disease. American Journal of Hematology, v. 91, n. 2, p. 238-242, 2016.

MARAHATTA, A. et al. Genetic Variants That Influence Fetal Hemoglobin Expression from Hydroxyurea Treatment. Blood, v. 35, n.1, p. 8-9, 2020.

MCGANN, P.T.; WARE, R.E. Hydroxyurea therapy for sickle cell anemia. Expert Opinion on Drug Safety, v. 14, n. 11, p. 1749-1758, 2015.

PECKER, L. H; SCHAEFER, B. A; LUCHTMAN, J. L. Knowledge insufficient: the management of haemoglobin SC disease. British Journal of Haematology, v. 176, n. 4, p. 515–526, 2017.

PEDROSA, A. M.; LEAL, L. K. A. M.; LEMES, R. P. G. Effects of hydroxyurea on cytotoxicity, inflammation and oxidative stress markers in neutrophils of patients with sickle cell anemia: dose-effect relationship. Hematology, Transfusion and Cell Therapy, v. 43, n. 4, p. 468-475, 2020.

PHILLIPS, K. et al. Hydroxyurea therapy in UK children with sickle cell anaemia: A single-centre experience. Pediatric Blood & Cancer, v. 65, n. 2, e26833, 2017.

PICCIN, A. et al. Insight into the complex pathophysiology of sickle cell anaemia and possible treatment. European Journal of Haematology, v.102, p. 319-330, 2019.

QUINN, C. T. et al. Early initiation of hydroxyurea (hydroxycarbamide) using individualised, pharmacokinetics‐guided dosing can produce sustained and nearly pancellular expression of fetal haemoglobin in children with sickle cell anaemia. British Journal of Haematology, v. 194, n. 3, p. 617-625, 2021.

RENÓ, C.O. et al. Oxidative stress assessment in sickle cell anemia patients treated with hydroxyurea. Annals of Hematology, v. 99, n. 5, p. 937-945, 2020.

RODRIGUEZ, A. et al. Hydroxyurea (hydroxycarbamide) genotoxicity in pediatric patients with sickle cell disease. Pediatric Blood & Cancer, v. 65, n.7, e.27011, 2018.

ROUMENINA, L. T. et al. Complement activation in sickle cell disease: Dependence on cell density, hemolysis and modulation by hydroxyurea therapy. American Journal of Hematology, v. 95, n. 5, p. 456–464, 2020.  

ROTHER, R. P. et al. The Clinical Sequelae of Intravascular Hemolysis and Extracellular Plasma Hemoglobin. A Novel Mechanism of Human Disease. JAMA, v. 293, n.13, p. 1653-1662, 2005.

SCHUCHARD, S. B. et al. Hydroxyurea use in young infants with sickle cell disease. Pediatric Blood & Cancer, v. 66, e27650, 2019.

SILVA, M. C.; SHIMAUT, E. L. T. Eficácia e toxicidade da hidroxiuréia em crianças com anemia falciforme. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, v. 28, n. 2, p. 144-148, 2006.

STEINBERG, M. H. et al. Fetal hemoglobin in sickle cell anemia: a glass half full? Blood, v. 123, p. 481-485, 2014.

SUBOTIČKI, T. A. et al. Nitric Oxide Synthase Dependency in Hydroxyurea Inhibition of Erythroid Progenitor Growth. Genes, v. 12, n. 1145, 2021. 

SUMMARELL, C. C.; SHEEHAN, V.A. Original Research: Use of hydroxyurea and phlebotomy in pediatric patients with hemoglobin SC disease. Experimental Biology and Medicine, v. 241, n. 7, p. 737-744, 2016.

TAYLOR, J. G. et al. Chronic Hyper-Hemolysis in Sickle Cell Anemia: Association of Vascular Complications and Mortality with Less Frequent Vasoocclusive Pain. Plos One, v. 3, n. 5, e2095, 2008.

TELEN, M. J. Beyond hydroxyurea: new and old drugs in the pipeline for sickle cell disease. Blood, v. 127, n. 7, p. 810-819, 2016.

THOMAS, R. et al. Prospective longitudinal follow-up of children with sickle cell disease treated with hydroxyurea since infancy. Pediatric Blood & Cancer, e27816, 2019.

TSHILOLO, L. et al. Hydroxyurea for Children with Sickle Cell Anemia in Sub-Saharan Africa. New England Journal of Medicine, v. 380, n. 2, p. 121-131, 2018.

VAN GEYZEL, L. et al. Higher oxygen saturation with hydroxyurea in paediatric sickle cell disease. Archives of Disease in Childhood, archdischild, v. 105, p. 575-579, 2019.

VINHAES, C. L. et al. Hydroxyurea treatment is associated with reduced degree of oxidative perturbation in children and adolescents with sickle cell anemia. Nature Research, v.10, e18982, 2020.

WALKER, A. L.; OFORI-ACQUAH, S. Dissection of the Expression Patterns of HydroxyureaTransporters during Erythropoiesis and Myelopoiesis. Blood, v. 126, n. 23, p. 3396, 2015. 

WARE, R. E. et al. Pharmacokinetics, pharmacodynamics, and pharmacogenetics of hydroxyurea treatment for children with sickle cell anemia. Blood, v. 118, n. 18, p. 4985-4991, 2011.

WARE, R. E. et al. Sickle cell disease. Lancet, v. 390, p. 311-323, 2017.

WARE, R. E.; DERTINGER, S. D. Absence of hydroxyurea‐induced mutational effects supports higher utilisation for the treatment of sickle cell anaemia. British Journal of Haematology, v. 194, n. 2, p. 252-266, 2021.

WILLIAMS, T. N.; THEIN, S. L. Sickle Cell Anemia and Its Phenotypes. Annual Review of Genomics and Human Genetics, v. 191, p. 113-147, 2018.

ZHU, X. et al. Hydroxyurea differentially modulates activator and repressors of γ-globin gene in erythroblasts of responsive and non-responsive patients with sickle cell disease in correlation with Index of Hydroxyurea Responsiveness. Haematologica, v. 102, n. 12, p. 1995-2004, 2017.

CAPÍTULO 2

AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS PRODUZIDOS NA REGIÃO NORDESTE DO BRASIL

PHARMACOLOGICAL EVALUATION OF ESSENTIAL OILS PRODUCED IN THE NORTHEAST REGION OF BRAZIL

DOI: https://doi.org/10.56001/22.9786500466386.02

Submetido em: 02/08/2022

Revisado em: 15/10/2022

Publicado em: 03/11/2023

Alice Lima Rosa Mendes

Universidade de Brasília, Pós-graduanda em Nanociência e Nanobiotecnologia, Brasília-DF

http://lattes.cnpq.br/0937593399537592

Mayara Ladeira Coêlho

Centro Universitário UNIFACID, Doutora em Biotecnologia pela Rede Nordeste de Biotecnologia – RENORBIO – Teresina-Piauí

http://lattes.cnpq.br/5634589156742478

Jairelda Sousa Rodrigues

Centro Universitário UNIFACID, Doutora em Biotecnologia pela Rede Nordeste de Biotecnologia – RENORBIO – Teresina-Piauí

http://lattes.cnpq.br/9271149529096985

Resumo

Os óleos essenciais são utilizados em nossos antepassados, como ação terapêutica, extraídos por diversas partes da planta como flor, folha, fruto através de técnicas de arraste a vapor. A indústria farmacêutica utiliza mais de 300 óleos essenciais de diversas plantas no mundo. A presente pesquisa, teve como objetivo, avaliar as principais ações farmacológicas dos compostos extraídos dos óleos essenciais produzidos em cada estado da região nordeste do Brasil. O presente estudo trata-se de uma pesquisa bibliográfica do tipo revisão integrativa da literatura, para o levantamento dos artigos, a coleta de dados foi realizada por meio das bases de dados: MEDLINE, LILACS, SciELO, Science Direct e BDTD. Para a realização do levantamento de dados da pesquisa, foi usada a combinação das palavras-chave, consideradas Descritores em Ciência e Saúde (DeCS). Os termos foram utilizados palavras com os descritores palavras do título e do resumo. Foram analisadas publicações no período de 2010 a 2020, nos idiomas português, inglês e espanhol. Diante disso, os resultados revelaram que os 23 artigos selecionados apresentaram predominância da abordagem descritiva e quantitativa. Nessa perspectiva, com o que foi analisado, a espécie que mais obteve artigos publicados nas bases de dados foi a Croton rudolphianus, seguido por Citrus aurantium, Lippia sidoides, Melissa officinalis e por último Cymbopogon schoenanthus e Hyptis dilatata Benth. Os OEs apresentaram uma vasta atividade antimicrobiana, frente à várias espécies de bactérias e fungos, assim como, uma diversidade de compostos bioativos entre os seus constituintes fitoquímicos e farmacológicos.

Palavras-Chave: Estados; Atividade bacteriana; Atividade Antifúngica; Atividade Fitoquímica; Plantas.

Abstract

Essential oils are used in our ancestors, as a therapeutic action, extracted by different parts of the plant such as flower, leaf, fruit through steam drag techniques. The pharmaceutical industry uses more than 300 essential oils from different plants in the world. This research aimed to evaluate the main pharmacological actions of compounds extracted from essential oils produced in each state in northeastern Brazil. The present study is a bibliographic research of the integrative literature review type, for the survey of articles, data collection was carried out through the following databases: MEDLINE, LILACS, SciELO, Science Direct and BDTD. To carry out the survey data, a combination of keywords, considered Descriptors in Science and Health (DeCS) was used. The terms were used with the descriptors words of the title and abstract. Publications from 2010 to 2020 were analyzed, in Portuguese, English and Spanish. Therefore, the results revealed that the 23 selected articles presented a predominance of the descriptive and quantitative approach. In this perspective, with what was analyzed, the species that most obtained articles published in the databases was Croton rudolphianus, followed by Citrus aurantium, Lippia sidoides, Melissa officinalis and finally Cymbopogon schoenanthus and Hyptis dilatata Benth. The EOs showed a vast antimicrobial activity, against several species of bacteria and fungi, as well as a diversity of bioactive compounds among their phytochemical and pharmacological constituents.

Keywords: States; Bacterial activity; Antifungal Activity; Phytochemical Activity; Plants.

Introdução

Desde a antiguidade, os egípcios utilizavam esses óleos essenciais como perfumes nos rituais de mumificação e religiosos. Os óleos essenciais (OE) são extraídos através de técnicas de arraste a vapor e prensagem de diversas partes das plantas. (REZENDE, 2020).  A indústria alimentícia, cosmética, perfumaria e farmacêutica são as que mais negociam essa matéria-prima para a produção de aromas e fragrâncias. A indústria farmacêutica possui um grande potencial nas pesquisas biotecnológicas.

Os óleos essenciais possuem características naturais como cheiro e sabor. Possuem compostos voláteis naturais, que apresentam compostos como: monoterpenos, diterpenos, sesquiterpenos. Possuem também os compostos que apresentam atividade antiinflamatória; antitumoral; anticoagulante; anticancerígenas; antifúngicas como a terpinen-4-ol, piperidina, cariofileno, D miristicina, germacreno. Esses compostos, são produzidos por plantas que apresentam atração de polinizadores na proteção das plantas e dos ambientes com temperaturas elevadas atuando no ataque e na defesa dos predadores (INACIO, 2014).

Os óleos essenciais possuem atividade farmacológica anti-inflamatória, antibacteriana, antifúngica, analgésica, cicatrizantes, hormonais, antissépticos (MAGALHÃES et al., 2015). Nesse sentido, a pesquisa teve como objetivo, avaliar os principais compostos fitoquímicos, extraídos dos óleos essenciais produzidos em cada estado da região nordeste do Brasil e fazer um estudo literário das ações farmacológicas existentes em cada óleo, observando a ação terapêutica.

Metodologia

Trata-se, de uma pesquisa bibliográfica do tipo revisão integrativa da literatura sobre os estudos que identificaram a avaliação farmacológica de óleos essenciais produzidos na região nordeste do Brasil.  A coleta de dados foi realizada por meio das bases de dados: MEDLINE (Medical Literature Analysis and Retrieval System Online), LILACS (Literatura Latino-Americana em Ciências de Saúde), SciELO (Scientific Eletronic Library Online) e BDTD (Biblioteca Digital Brasileira de Teses e Dissertações). Foi usada a combinação das seguintes palavras-chave, consideradas nos Descritores em Ciência e Saúde (DeCS): “Plantas” AND “Atividade bacteriana”; “Atividade Antifúngica” AND “Plantas”; “Estados” AND “Plantas”; “Atividade fitoquímica”. Os termos foram utilizados palavras com os descritores palavras do título e do resumo utilizando publicações no período de 2010 a 2020, nos idiomas português, inglês e espanhol.

Os critérios de inclusão consistiram em artigos publicados nos últimos dez anos, disponíveis para acesso gratuito, na íntegra, em idioma português, inglês e espanhol, que abordaram a temática proposta. Foram excluídos da pesquisa os editoriais, resumos, cartas ao editor, artigos repetidos, revisões bibliográficas e estudos que não corresponderam à temática relevante ao alcance do objetivo da revisão.

Na primeira etapa foi definida a questão norteadora e formulada a pergunta da pesquisa, sendo a mesma direta e clara; na segunda etapa foram estabelecidos os parâmetros de inclusão e exclusão; na terceira etapa identificaram-se os estudos pré-selecionados e selecionados; quarta etapa categorizou-se os artigos designados; na quinta etapa analisou-se e interpretaram-se os resultados e finalmente na sexta etapa os resultados da revisão foram expostos (BOTELHO; CUNHA; MACEDO, 2011).

A análise dos estudos selecionados em relação ao delineamento da pesquisa, foi realizada de forma descritiva, possibilitando observar, descrever e classificar os dados, com intuito de reunir o conhecimento produzido sobre o tema a ser explorado.

Resultados e Discussão

Dessa forma, foram excluídos artigos em que não citavam as palavras chaves, artigos que não estavam no período em que foi realizado a pesquisa e artigos que não citavam as atividades farmacologia dos óleos essenciais. Os artigos a redação final desta revisão integrativa, foram utilizados 23 estudos referentes aos óleos essenciais de plantas típicas da região nordeste que apresentam atividade antimicrobiana.  No Gráfico 1 analisa-se as bases de dados Science Direct, Medline/Pubmed, Scielo e BDTD de acordo com o ano de publicação.

Gráfico 1: Conforme o ano de publicação e as bases de dados.

Fonte: Dados da pesquisa, 2021.

Diante disso, verificou-se que a maioria dos estudos entre o período de 2019-2020 (n=6) e 2013-2014 (n=7), uma grande quantidade de estudos examinados em relação aos anos nas bases de dados pesquisadas, há um grande interesse na pesquisa científica em relação aos óleos essenciais, seguido de 2017-2018 (n=3), 2015-2016 (n=3) e 2010-2012 (n=4) um menor interesse de publicações nesses anos. A base de dados em que foi possível encontrar um maior número de publicações foi a Medline/Pubmed, com publicações de natureza internacional, com 40% (n= 25) dos artigos encontrados tiveram atividade fitoquímica, 31% (n=23) em atividade antibacteriana e 29% (n=19) atividade antifúngica. Os óleos essenciais eles possuem uma ação farmacológica contra vários tipos de microrganismo e sua importância para o desenvolvimento de novos bioprodutos. A Tabela 1 mostra plantas medicinais pesquisadas e classificadas por região onde são encontradas na região nordeste do Brasil, analisando o tipo de método utilizado, parte da planta utilizada para extração do óleo e sua atividade farmacológica.

Tabela 1: Plantas medicinais pesquisadas e sua classificação conforme a região brasileira de ocorrência, quantitativo de menções nos artigos e para obtenção dos óleos essenciais.

Fonte: Dados da pesquisa, 2021.

Os tipos de plantas medicinais encontradas na região nordeste do Brasil, que possuem o nome popular e científico da planta, averiguando assim a quantidade de artigos selecionados dentre os 9 estados da região nordeste do Brasil. Desta forma a Tabela 4 a seguir expõe todos os achados referentes a presente pesquisa.

Tabela 4: Levantamento descritivo dos estudos pesquisados, classificados por autor, ano, título do artigo, tipo de estudo e resumo.

Fonte: Dados da pesquisa,2021.

Esse estudo revelou que estudar as atividades biológicas de representantes das famílias Asteraceae (Achillea millefolium e Calendula officinalis) e Lamiaceae (Melissa officinalis e Origanum majorana) Garcia-Risco et al. (2017), observaram que a espécie M. officinalis é rica em monoterpenos e sesquiterpenos com 7-12% de álcoois cíclicos. Pourghanbari et al. (2016) e Taherpour et al. (2012) encontraram resultados bem próximos ao observar a composição do óleo essencial de Melissa officinalis, chegando à conclusão de que o óleo da planta é composto principalmente por geranial, neral e citronelal.

Os principais compostos presentes nos óleos e extratos obtidos das folhas e flores de Hyptis dilatata Benth (Lamiaceae) foram α-pineno, β-pineno, limoneno, 3-careno, β-cariofileno, fenchona e cânfora, e o perfil fitoquímico dos extratos mostraram presença de cumarina, flavonoides, fenóis, saponinas, alcaloides. Em relação às atividades biológicas, tanto os extratos quanto os óleos apresentaram atividade antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus e Bacillus cereus, Candida albicans e Salmonella typhymurium (ALMEIDA et al., 2017).

No estudo realizado por Bastos et al. (2020) ao analisarem a composição química do óleo essencial de Piper nigrum L por meio de cromatografia gasosa acoplada a espectroscopia de massa (CM-MS), observaram que o Piper nigrum L é composto por cerca de 15 componentes, principalmente monoterpenos e sesquiterpenos, dentre eles os majoritários foram o β-cariofileno (28%), limoneno (15%), sabineno (11,4%). Costa et al, (2020) demonstraram após a análise da composição química do óleo essencial in natura que os principais constituintes são o E-cariofileno (34,87%), sabineno (14,96%), silvestreno (14,17%) e αpineno (5,28%). O estudo é crucial uma vez que fornece uma alternativa nova para a utilização do produto natural.

Estudos como o de Esteves e Ecker et al. (2020) avaliaram a atividade antimicrobiana do óleo essencial de Eucalyptus urograndis frente às cepas de Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, que frequentemente têm sido associadas às infecções em seres humanos. O estudo indica a presença de monoterpenos, citronelal e isopulegol no óleo essencial de E. urograndis. A concentração inibitória mínima para as cepas de E. coli e P. aeruginosa foram de 256 μg/mL e 16 μg/mL, respectivamente, indicando uma possível alternativa no tratamento de infecções causadas por microrganismos resistentes aos tratamentos convencionais.

Em outros estudos realizados por Cardoso et al. (2019) e Alcantara et al. (2019), o Eucalyptus urograndis mostrou bastante efeito também contra Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli por meio do método de inoculação in vitro do disco de papel de Bauer e o método de difusão em ágar, porém os autores mencionam que a ação da substância é mais efetiva em gram-positivos como o S. aureus, sendo observada eficiente inibição do microrganismo em diluições de 1:100.

Ao estudar a composição química do óleo essencial de Cymbopogon schoenanthus, encontraram resultados semelhantes posto que a análise da constituição química por cromatografia gasosa acoplada a espectroscopia de massas (CG-EM) mostrou alta dominância de monoterpenos oxigenados (62,1%) seguido por sesquiterpenos oxigenados (21,6%), sendo a a piperitona (59,1%) e o limoneno (13,7%) os seus constituintes em maior proporção (YAGI et al.,2020).

Além de atividade antibacteriana, Malti et al., (2020) mostraram em seu estudo que o OECS possui atividade antifúngica contra as espécies Candida albicans, Aspergillus flavus e Fusarium oxysporum com halos de inibição que ficaram entre 13,5 ± 2,1 mm e 32,5 ± 0,7 mm, porém os constituintes químicos principais do óleo encontrados nesse estudo foram o cis-p-mentano-2-en-1-ol (28,5%), trans-p-mentano-2-en-1-ol (16,3%), cis-etrans-piperitols (8,5%).

Estudo realizados por Teneva et al. (2019) e HOU et al. (2019) objetivaram analisar a composição química e outras atividades biológicas do óleo essencial de Citrus aurantium e observaram que a os microrganismos gram-positivos (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis) foram mais sensíveis quando comparados com os gram-negativos (Salmonella sp, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli) testados, pois apresentaram áreas de inibição entre 9 e 21 mm com concentração inibitória mínima acima de 600 ppm.

No estudo realizado por Baldim et al. (2019) conseguiram encapsular o óleo essencial de Lippia sidoides em nanosistemas lipídicos por meio do processo de emulsificação por inversão de fase. Foram criadas formulações contendo o OE puro, o timol (seu constituinte principal) é a base lipídica carreada com o óleo essencial para a avaliação da atividade antifúngica frente à Candida albicans. Foi observado que tanto o óleo puro como a base contendo o óleo carreado apresentaram inibição micelial significativa, com concentrações que variaram entre 156 e 312 μg / mL. Os autores mencionam a importância do estudo como ponto de partida para novas pesquisas para a formação nova de sistemas antimicrobianos promissores, podendo ser empregado em várias áreas da indústria. Morais et al., (2012) constataram após realizarem a análise dos constituintes químicos do óleo essencial de Lippia sidoides, que o mesmo possui o 1,8 cineol, um monoterpeno oxigenado como o principal componente (26,67%), seguido por isoborneol (14,60%) e acetato de bornila (10,77%).

No entanto Rocha et al., (2020) ao fazer a análise da composição química do OECP observaram que o acetato de crisantenila (27,05%), α-terpineno (19,21%) e o-cimeno (12,27%) foram os compostos mais prevalentes, e além disso o composto apresentou atividade antimicrobiana tanto em cepas padronizadas, como em isolados clínicos de S. aureus, apresentando concentração inibitória mínima acima de 8.000 µg/mL. De acordo com Ribeiro et al., (2016) o óleo essencial de Croton rudolphianus possui o metil chavicol (20,55%), seguido de (E)- cariofileno (11,21%), biciclogermacreno (10,23%), germacreno D (7,51%) como constituintes majoritários e apresentou ação antibacteriana contra Xanthomonas campestres, Pectobacterium carotovorum, Xanthomonas campestris, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestres, com valores de concentração inibitória mínima e máxima de de 1,56 e 25 µL/mL (para Ralstonia solanacearum e Pectobacterium carotovorum, nessa ordem).

Ao estudar a composição química do OEPC e a interferência do tempo de extração na quantificação dos metabólitos secundários, Costa et al. (2013) observaram que em todas as frações de tempo observadas, os componentes majoritários foram o patchoulol (55,74% a 64,81%), alfa-bulneseno (5,01% a 8,99%), pogostol (4,20% a 5,11%). Há relato também de atividade antifúngica do óleo essencial de Patchouli (Pogostemon cablin), Banu et al., (2018) mostraram em seu estudo a ação inibitória frente ao biofilme de três espécies de Candida spp com atividade totalmente dependente da concentração utilizada.

­­Considerações Finais

Esse estudo revelou que a ação dos óleos essenciais de várias espécies de plantas no crescimento microbiano frente a várias espécies de bactérias e fungos. Assim como a sua devida composição química com uma diversidade de compostos bioativos entre os seus constituintes químicos e fitoquímicos.

As espécies que foram encontradas na região nordeste (Cymbopogon schoenathus, Piper nigrum L., Lippia sidoides, Hyptis dilatata benth, Citrus aurantiu, Cróton pulegiodorus, Melissa officinalis, Eucalyptus urograndis e Patchouli), que foram o foco do trabalho resultando em 23 artigos, em que essas espécies são bastante típicas no nordeste brasileiro, evidenciando que os derivados vegetais podem ser uma grande alternativa em potencial, eficaz para o enfrentamento da resistência aos antimicrobianos, ao tratamento de infecções tópicas e sistêmicas, e seus empregos na indústria de alimentos como agentes conservantes.

Porém ainda são necessários mais estudos em modelos in vitro e in vivo, para que haja um melhor entendimento em relação aos mecanismos de ação desses produtos e avaliação da segurança e eficácia.

Referências

ALMEIDA, S. P. et al. Estudos químicos e biológicos dos óleos essenciais e extratos de HyEstudos químicos e biológicos dos óleos essenciais e extratos de Hyptis dilatata Benth (lamiaceae), procedentes da Serra do Tepequém-Amajari/Roraima. 2017.

AZEVEDO, F. L. A. A. Valor nutricional, capacidade antioxidante e utilização de folhas de espinafre (Tetragonia tetragonoides) em pó como ingrediente de pão de forma. 130 f. Tese (Doutorado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) – Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, 2012.

BALDIM, I. et al. Lippia sidoides essential oil encapsulated in lipid nanosystem as an anti-Candida agent. Industrial Crops and Products, v. 127, p. 73-81, 2019.

BANU, S. F. et al. Effects of patchouli and cinnamon essential oils on biofilm and hyphae formation by Candida species. Journal de Mycologie Médicale, v. 28, n. 2, p. 332-339, 2018.

CARDOSO, R. C. et al. Potencial Antimicrobiano do Óleo da Folha de Eucalyptus urograndis Frente Stafilococus aureus. ID on line Revista de Psicologia, v. 13, n. 43, p. 989-1002, 2019.

CAROCHO, M. et al. Melissa officinalis L. decoctions as functional beverages: a bioactive approach and chemical characterization. Food & function, v. 6, n. 7, p. 2240-2248, 2015.

CRUZ, B. C. et al. Susceptibility of Rhipicephalus (Boophilus) microplus to ivermectin (200, 500 and 630 μg/kg) in field studies in Brazil. Veterinary parasitology, v. 207, n. 3-4, p. 309-317, 2015

ESTEVES, F. M.; ECKER, A. B. S. Avaliação da atividade antimicrobiana in vitro do óleo essencial de Eucalyptus urograndis em cepas padrão de bacilos gram negativos. Revista Uningá, v. 57, n. 1, p. 11-23, 2020.

GOLDBECK, J. C. et al. Bioactivity of essential oils from Eucalyptus globulus and Eucalyptus urograndis against planktonic cells and biofilms of Streptococcus mutans. Industrial Crops and Products, v. 60, p. 304-309, 2014.

GARCÍA-RISCO, M. R. et al. Biological activities of Asteraceae (Achillea millefolium and Calendula officinalis) and Lamiaceae (Melissa officinalis and Origanum majorana) plant extracts. Plant foods for human nutrition, v. 72, n. 1, p. 96-102, 2017.

HASHIM, G. M. et al. Biological activity of Cymbopogon schoenanthus essential oil. Saudi Journal of Biological Sciences, v. 24, n. 7, p. 1458-1464, 2017.

INÁCIO, M. C.; PAZ, T. A.; BERTONI, B. W.; VIEIRA, M.  A.  R.; MARQUES, M.  O.; PEREIRA, A. M.  S. Histochemical   investigation   of Cochlospermum regium(Schrank) Pilg.    Leaves    and    chemical composition of its essential  oil. Natural Product Research, v. 28, n. 10, p. 727-731, 2014.

MAGALHÃES, C. R. I. et al. Potencial inseticida de óleos essenciais sobre Tribolium castaneum em milho armazenado. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 17, n. 4, sup. III, p. 1150 – 1158, 2015.

MALTI, C. E. W. et al. Composition, chemical variability and biological activity of Cymbopogon schoenanthus essential oil from Central Algeria. Chemistry & Biodiversity, 2020.

METOUI, N. et al. Activity antifungal of the essential oils; aqueous and ethanol extracts from Citrus aurantium L. Natural product research, v. 29, n. 23, p. 2238-2241, 2015.

PEREIRA, C. T. M. et al. Microbiology quality, detection of enterotoxin genes and antimicrobial resistance of Staphylococcus aureus isolated from milk and Coalho cheese. Semina: Ciências Agrárias, Londrina, v. 39, n. 5, p. 1.957-1.968, set./out. 2018.

POURGHANBARI, G. et al. Antiviral activity of the oseltamivir and Melissa officinalis L. essential oil against avian influenza A virus (H9N2). Virus Disease, v. 27, n. 2, p. 170-178, 2016.

REZENDE, D. A. C. S. Óleos essenciais de Satureja montana L., Myristica fragrans H. e Cymbopogon flexuosus: extração, caracterização química e avaliação das atividades biológicas. 125 p. Tese (Doutorado em Agroquímica) – Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2020.

RIBEIRO, I. A. T. A. Caracterização química e atividades biológicas do óleo essencial de Croton rudolphianus Müll. Arg.(Euphorbiaceae). Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de Pernambuco. 2016.

ROCHA, R. R. Estudo comparativo sobre a composição química, atividade antibacteriana e efeito sinérgico dos óleos essenciais de Croton tetradenius Baill. e c. pulegiodorus Baill. Contra isolados de Staphylococcus aureus. 2020.

SUNTAR, I.; KHAN, H.; PATEL, S.; CELANO, R.; RASTRELLI, L. An Overview on Citrus aurantium L.: Its Functions as Food Ingredient and Therapeutic Agent. Oxid Med Cell Longev, v. 2, may. 2018.

SUNTAR, I. et al. An overview on Citrus aurantium L.: its functions as food ingredient and therapeutic agent. Oxidative medicine and cellular longevity, v. 2018, 2018.

VÁZQUEZ-SÁNCHEZ, D. et al. Control of Staphylococcus aureus biofilms by the application of single and combined treatments based in plant essential oils. International journal of food microbiology, v. 286, p. 128-138, 2018.

VIEIRA, F. A. P. Estudo químico e avaliação da atividade microbiológica do óleo essencial das folhas de Hyptis Dilatata Benth. 2018.

YANG, X. et al. Evaluation of the antibacterial activity of patchouli oil. Iranian journal of pharmaceutical research: IJPR, v. 12, n. 3, p. 307, 2013.

YANG, X. et al. Evaluation of the antibacterial activity of patchouli oil. Iranian journal of pharmaceutical research: IJPR, v. 12, n. 3, p. 307, 2013.

CAPÍTULO 3

TESTES ANTIOXIDANTES EM FLAVONOIDES DE RECURSOS NATURAIS: UMA REVISÃO INTEGRATIVA

ANTIOXIDANT TESTS ON FLAVONOIDS OF NATURAL RESOURCES: A INTEGRATIVE REVIEW

DOI: https://doi.org/10.56001/22.9786500466386.03

Submetido em: 06/06/2022

Revisado em: 16/06/2022

Publicado em: 24/06/2022

Manoela Cavalcante Ribeiro

Centro Universitário UNIFACID, Pós-graduanda em Farmacologia Clínica/ Prescrição Farmacêutica e Farmácia Hospitalar– Teresina-Piauí.

http://lattes.cnpq.br/3883022215150444

Fernanda Arias de Almeida Macedo

Centro Universitário UNIFACID, Especialização em Farmácia Hospitalar com Ênfase em Farmácia Clínica e Gestão – Teresina-Piauí.

http://lattes.cnpq.br/2159614718438070

Anny Louisy de Sousa Macêdo

Centro Universitário UNIFACID, Farmacêutica – Teresina-Piauí.

http://lattes.cnpq.br/0796150705273237

Alice Lima Rosa Mendes

Universidade de Brasília, Pós-graduanda em Nanociência e Nanobiotecnologia, Brasília-DF

http://lattes.cnpq.br/0937593399537592

Mayara Ladeira Coêlho

Centro Universitário UNIFACID, Doutora em Biotecnologia pela Rede Nordeste de

Biotecnologia – RENORBIO – Teresina-Piauí

http://lattes.cnpq.br/5634589156742478

Resumo

Os flavonoides são compostos de natureza fenólica e são caracterizados por sua forte atividade antioxidante, uma propriedade importante extraída em algumas espécies de plantas, sendo utilizados na proteção dos organismos vivos aos radicais livres, com função fisiológica nos mecanismos de sinalização celular, eliminação de germes, entre outras ações. O trabalho proposto tem como objetivo realizar uma revisão integrativa para analisar as metodologias utilizadas para testar a capacidade antioxidante de flavonoides. A revisão da literatura foi realizada nas bases de dados Scielo, Pubmed e Lilacs, que foi realizada no período de Agosto e Setembro de 2019, selecionando artigos entre os anos de 2015 e 2019 com os descritores “flavonoids” e “antioxidante”. Foram elaboradas tabelas descrevendo o 1ª autor, título, objetivo e a base de dados dos artigos selecionados. As metodologias para o isolamento e atividade antioxidante são diversas, tendo como as mais utilizadas e validadas: cromatografia em camada analítica, HUCSE, cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC), DPPH, ABTS, FRAP (Poder antioxidante ferro-redutor).

Palavras-chaves: Radicais livres; Oxidação; Cromatografia

Abstract

Activity, an important property extracted in some plant species, being used in the protection of living organisms against free radicals, with physiological function in the mechanisms of cellular signaling, elimination of germs, among other actions. The proposed work aims to carry out a integrative review to analyze the methodologies used to test the antioxidant capacity of flavonoids. The literature review was carried out in the Scielo, Pubmed and Lilacs databases, which was carried out between August and September 2019, selecting articles between the years 2015 to 2019 with the descriptors “flavonoids” and “antioxidant “. Tables were drawn up describing the 1st author, title, objective and the database of the selected articles. The methodologies for isolation and antioxidant activity are diverse, having as the most used and validated: chromatography in analytical layer, HUCSE, high performance liquid chromatography (HPLC), DPPH, ABTS, FRAP (Iron-reducing antioxidant power).

Keywords: Free radicals; Oxidation; Chromatography.

Introdução

Os flavonoides são compostos de natureza fenólica e são caracterizados por sua forte atividade antioxidante, uma propriedade importante presente nas plantas, utilizadas na proteção dos organismos vivos contra os radicais livres, pois possuem as funções fisiológicas nos mecanismos de sinalização celular, eliminação de germes, entre outras ações, mas são instáveis e extremamente reativos, combinados de maneira inespecífica na maioria dos casos, de modo a prejudicar a diversidade de moléculas que integram a estrutura celular (FERRER, 2017).

Polifenóis e flavonoides funcionam como reagentes quimio-preventivos contra espécies reativas de oxigênio induzem a danos oxidativos e inibem as enzimas hidrolisantes de carboidratos. Eles são comumente encontrados em nozes, vegetais, frutas e chás (IBRAHIM, 2017).

Segundo os órgãos de saúde pública como OMS a utilização extensiva de antioxidantes sintéticos e sua ingestão prolongada pode ser associado com aparecimento de doenças. A pesquisa por antioxidantes naturais é uma nova tendência de mercado fármaco e industrial, pois, além de manter as propriedades organolépticas e químicas de alimentos, também são associados a manutenção de saúde e prevenção de doenças (FERREIRA, 2016).

Atividade de radicais livres, fatores químicos e físicos são responsáveis pelo envelhecimento celular, esse processo fisiológico causa patologias como doenças cardiovasculares, câncer, diabetes, artrite, mal de Parkinson e Alzheimer, entre outros. Os agentes antioxidantes podem servir como fatores defensivos contra radicais livres no corpo humano (ZARATE, 2018).

Dessa forma, o estudo proposto teve como objetivo realizar uma revisão bibliográfica para analisar as metodologias utilizadas para testar a capacidade antioxidante de flavonoides.

Metodologia

Esse trabalho foi elaborado a partir de uma revisão da literatura nas bases de dados Scielo, Pubmed e Lilacs. A pesquisa foi realizada no período de agosto e setembro de 2019. Foram selecionados artigos entre os anos de 2015 e 2019. Os descritores utilizados “flavonoids” e “antioxidant”. Os critérios de inclusão foram: artigos publicados nos periódicos indexados, publicações cuja os termos indexadores constam no título ou resumo das pesquisas e publicações dentro do período estipulado para pesquisa. E os critérios de exclusão foram artigos publicados antes de 2015, artigos em um idioma diferente do inglês, português e espanhol e apenas artigos que possuíssem os descritores no título e resumo.

Os resumos foram lidos e os artigos que atenderam aos critérios na íntegra. Foi desenvolvido um instrumento de coleta de informações para responder à questão de pesquisa desta revisão, composto pelos seguintes itens: autor, ano de publicação, título, objetivo e a base da publicação. Os dados foram apresentados em forma de tabela. Após a leitura dos artigos selecionados, foi realizada uma análise e organização. A análise, categorização e síntese dos temas foi realizado com o propósito de obter a melhor descrição e classificação dos resultados, após a leitura dessas publicações houve a constatação da sua relevância científica para o presente estudo.

Resultados e Discussão

Somando-se todas as bases de dados, foram encontrados 91 artigos. Após a leitura dos títulos dos artigos, notou-se que alguns deles se repetiram nas diferentes bases e outros não preenchiam os critérios deste estudo. Foram selecionados 48 artigos para a leitura completa e exclusão dos que não condizem ao propósito deste estudo, sendo a maior quantidade de exclusões referentes à não coerência do título com o objetivo do estudo (Tabela 1).

Tabela 1. Resultado da busca nas bases dados e seleção de artigos pertinentes.

Fonte: Dados da pesquisa, 2021.

Após análise detalhada e minuciosa dos artigos, foi feito uma nova eliminação. Visto que após a leitura dos artigos completos os objetivos relatados destes não coincidiam com o objetivo desta revisão. A (Tabela 2) demostra os artigos que sobraram para análise detalhada.

Tabela 2. Resultado da análise nas bases dados e seleção de artigos pertinentes após leitura completa.

Fonte: Dados da pesquisa, 2021.

Com a leitura total dos artigos selecionados, elaborou-se a (Tabela 3.1) e (Tabela 3.2) constando autor/ano, título, objetivo e a base de dados onde os artigos foram obtidos.

Tabela 3.1. Artigos selecionados relacionados por autor/ano, título, objetivo e base.

Fonte: Dados da pesquisa, 2021.

Tabela 3.2. Artigos selecionados relacionados por autor/ano, título, objetivo e base.

Fonte: Dados da pesquisa, 2021.

No estudo realizado por (HU, 2015) foi feito o isolamento de 16 tipos de flavonoides presente na flor de Chrysanthemum morifolim cv. Chuju através de um estudo químico dirigido, que se caracterizaram como: uercetina (1), isorhamnetina 3-O-b-D-glucósido (2), eriodictyol (3), piracantósido (4), apigenina (5), apigetrina (6), acacetina (7), acacipetalina (8), luteolina (9), diosmetina (10), espinacetina (11), axilarina (12), bonanzina (13), cirsiliol (14), crisossplenol D (15) e artemetina (16). Onde os flavonoides de 11 a 16 foram descritos pela primeira vez nesta espécie. Demonstraram alta capacidade antioxidante atraves do teste de captação do radical 2,2- difenil- 1-picrilhidrazilo (DPPH).

 Estudos relatam metodologias para testes antioxidantes em flavonoides através dos métodos de (CU,2017) DPPH, assay and the 2,2′‐azino bis (3‐ethylbenzothiazolin‐6‐sulfonic Acid (ABTS+). Através do teste ABTS foi constatado que tanto o flavonoide acacetina quanto o isoginkgetina aumentam significativamente a capacidade antioxidante. Os ensaios relataram boa atividade antioxidante realizados em ambos os testes descritos (GONZÁLEZ,2016) e (ZHOU, 2019).

No artigo de Gonzaléz (2016), os flavonoides foram isolados utilizando dois meios de reação, através do método de DPPH (sistema homogêneo) e uma solução micelar de Triton X-100 (sistema micro heterogêneo). E a capacidade antioxidante foi avaliada através da técnica de ESR, ORAC e branqueamento do radical DPPH. O composto 7-o-methyleriodictiol teve a maior capacidade antioxidante. Essa característica é constituída por causa da quantidade do grupo hidroxila e uma ligação dupla entre as posições C2 e C3 do anel C.

Nos trabalhos de Gwatidzo (2017), Liu (2019), Zhu (2015) e Zhang (2019), os flavonoides foram isolados por diversos métodos, como por exemplo, cromatografia em camada analítica, HUCSE, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e a partir dos isolados foram realizados os testes para atividade antioxidante através de ABTS, DPPH, FRAP (Poder antioxidante ferro-redutor). Com sua capacidade antioxidante, podem contribuir significativamente para a saúde humana, reduzindo o risco de doenças cardiovasculares, além de seus efeitos biológicos como antibacteriano, antiviral, anti-inflamatório, antialérgico e vasodilatador.

­­Considerações Finais

Esta revisão confirma a atividade antioxidante atribuída aos radicais fenólicos presentes na estrutura dos compostos flavonoides obtidos através dos extratos vegetais, substâncias essas atribuídas a grande importância benéfica para o organismo dos seres vivos pela sua capacidade de combater os radicais livres, que geram processos fisiológicos responsáveis pelo envelhecimento celular, causando diversas patologias. Não podem ser avaliados por apenas um método devido à sua natureza complexa, e todas as metodologias utilizadas demonstraram eficácia e validação ao comprovarem a alta atividade antioxidante dos flavonoides isolados e sua importância como fonte potencial em recursos naturais.

Referências

ALVES AM, DIAS T, HASSIMOTTO NM, NAVES MMV et al. Ascorbic acid and phenolic contentes, antioxidante capacity and flavonoids composition of Brazilian Savannah native fruits. Food. S. Ci. Technol. 2017;37(4):564-569.

BALDIM J,  Alcântara BGV, Domingos OS, Soares MG, Caldas IS, Novaes RD. et al. The Correlation between Chemical Structures and Antioxidant, Prooxidant, and Antitrypanosomatid Properties of Flavonoids. Oxid. Med. Cell. Longev. 2017;2017:3789856.

BUSTAMANTE PDV.  Evaluación de la actividad antioxidante y determinación del contenido de fenoles totales y flavonoides de hojas de diferentes genotipos de Ugni molinae Turcz [thesis]. Chile: Departamento de Bioquímica y Biología Molecular; 2015. 83 p.

FEFER G, Muñoz REO, Llanos BR, Zúñiga RJR, Cárdenas JLV, Contreras J. et al. Flavonoide de trece espécies del género Bursera com potencial antioxidante. Rev Polibotanica. 2017;(44):185-196.

FERREIRA TS, HELDWEIN AB, SANTOS CO, SOMAVILLA JC, SAUTTER CK. Substâncias fenólicas, flavonoides e capacidade antioxidante em erveiras sob diferentes coberturas do solo e sombreamentos.  Rev. Bras. Pl. Med. 2016;18 Suppl 2:S588-596.

GONZÁLEZ GB, Chamorro E, Salinas M, Modak B, Olea-Azar C. Evaluation of the antioxidant activity of the flavonoids isolated from Heliotropium sinuatum resin using ORACFL, DPPH and ESR methodologies. J. Chil. Chem. Soc. 2016;61(3):3125-3129.

GWATIDZO L, DZOMBA P, MANGENA M. TLC separation and antioxidante activity of flavonoids from Carissa bispinosa, Ficus sycomorus, and Grewia bicolar fruits. Rev. Soc. Bras. Aliment. Nutr. 2018;43:1020.

HU J, Ma W, Li N, Wang KJ. Antioxidant and Anti-Inflammatory Flavonoids from the Flowers of Chuju, a Medical Cultivar of Chrysanthemum Morifolim Ramat. J. Mex. Chem. Soc. 2017;61(4):282-289.

IBRAHIM S, Abdulrahman A, Amgad K, Gamal M. Antioxidant-amylase inhibitors flavonoids from Iris germanica rhizomes. Rev. Bras. Farmacogn. 2017:170-174.

LI X, Ouyang X, Cai R, Chen D. 3’,8”- Dimerization Enhances the Antioxidant Capacity of Flavonoids: Evidence from Acacetin and Isoginkgetin. Molecules. 2019;24(1):2039.

LIU Z, Kong L, Lu S, Zou Z. Application of a Combined Homogenate and Ultrasonic Cavitation System for the Efficient Extraction of Flavonoids from Cinnamomum camphora Leaves and Evaluation of Their Antioxidant Activity In Vitro. J. Anal. Methods. Chem. 2019;2019:4892635.

TIAN C, Chang Y,  Zhang  Z, Wang  H, Xiao  S, Cui  S et al. Extraction technology, component analysis, antioxidant, antibacterial, analgesic and anti-inflammatory activities of flavonoids fraction from Tribulus terrestris L. leaves. Heliyon. 2019;5(8):02234.

ZARATE MSH, JUÁREZ MRA, GARCÍA AC, LÓPEZ CO, CHÁVEZ AJG, GARFIAS JJN, RAMOS FA. Flavonoids, phenolic contente, and antioxidante activity of própolis from various áreas of Guanajuato, Mexico. Food Sci. Technol. 2018:201-215.

ZHANG Y, Chen S, Wei C, Gong H, Li  L, Xingqian Y.  Chemical and Cellular Assays Combined with In Vitro Digestion to Determine the Antioxidant Activity of Flavonoids from Chinese Bayberry (Myrica rubra Sieb. et Zucc.) Leaves. PLOS ONE. 2016;11(12):0167484.

ZHANG H,  Wu  K, Wang  M, Liu  P, Wang  X, Deng R et al. Antioxidant Activities and Chemical Constituents of Flavonoids from the Flower of Paeonia ostii. Molecules. 2016;22(1):5.

ZHANG L, Li L, Huang Y, Yunfeng P , Hou X, Song L et al. Identification and Antioxidant Activity of Flavonoids Extracted from Xinjiang Jujube (Ziziphus jujube Mill.) Leaves with Ultra-High Pressure Extraction Technology. Molecules. 2019;24(1):122.

ZHOU J, Zhang L, Li Q, Jin W, Chen W, Han J, Zhang Y. Simultaneous Optimization for Ultrasound-Assisted Extraction and Antioxidant Activity of Flavonoids from Sophora flavescens Using Response Surface Methodology. Molecules. 2019;24(1):112.

ZHU MZ, Wu  W, Jiao  L, Yang  PF, Guo MQ et al. Analysis of Flavonoids in Lotus (Nelumbo nucifera) Leaves and Their Antioxidant Activity Using Macroporous Resin Chromatography Coupled with LC-MS/MS and Antioxidant Biochemical Assays. Molecules. 2015;20:10553-10565.

CAPÍTULO 4

EFEITOS ANTI-INFLAMATÓRIOS DA Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.) B. Verl

ANTI-INFLAMMATORY EFFECTS OF Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.) B. Verl

DOI: https://doi.org/10.56001/22.9786500466386.04

Submetido em: 14/02/2022

Revisado em: 16/06/2022

Publicado em: 24/06/2022

Silvânia Narielly Araújo Lima

Universidade Federal de Campina Grande, Centro de Educação e Saúde, Cuité-PB

http://lattes.cnpq.br/4848390450941924

Amanda Geovana Pereira de Araújo

Universidade Federal de Campina Grande, Centro de Educação e Saúde, Cuité-PB.

http://lattes.cnpq.br/3946322725458190

Tainá Oliveira de Araújo

Universidade Federal de Campina Grande, Centro de Educação e Saúde, Cuité-PB

http://lattes.cnpq.br/8031037065925876

Anne Wirginne de Lima Rodrigues

Universidade Federal de Campina Grande, Centro de Educação e Saúde, Cuité-PB

http://lattes.cnpq.br/0355598894423144

Igor Luiz Vieira de Lima Santos

Universidade Federal de Campina Grande, Centro de Educação e Saúde, Cuité-PB

http://lattes.cnpq.br/6976858979875527

Resumo

O uso de anti-inflamatórios está aumentando a cada dia, no entanto, muitos deles são formulados com base sintética, causando diversos efeitos colaterais. Com isso, vê-se a importância da utilização de produtos naturais, os quais apresentam diversas propriedades e causam menos efeitos colaterais. Dentre os produtos naturais destaca-se a Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.) B. Verl devido às suas diversas propriedades benéficas, especialmente pelo efeito anti-inflamatório do seu extrato. Diante disto, o objetivo deste trabalho foi realizar uma revisão bibliográfica sobre a potente atividade anti-inflamatória do extrato da A. chica. Para tal, foram utilizados diferentes bancos de dados, como SciELO, MEDLINE, PubMed, dentre outros, para seleção dos trabalhos em diferentes idiomas. Diversos estudos demonstraram que as antocianinas, que são flavonoides, presentes na A. chica fazem com que essa planta apresente diversas propriedades, em especial, uma potente atividade anti-inflamatória, por diminuir a produção de citocinas pró-inflamatórias enquanto aumenta a produção da citocina anti-inflamatória e imunossupressora. Além disso, estudos também revelaram que o extrato dessa planta tem um maior efeito anti-inflamatório, confirmando o que vem sendo descrito na medicina popular. Portanto, os resultados obtidos neste trabalho estimulam o desenvolvimento de futuros estudos sobre plantas medicinais, especialmente sobre a A. chica, a fim de elucidar os mecanismos de ação envolvidos nas atividades anti-inflamatórias identificadas, além de reforçar suas potentes ações terapêuticas.

Palavras-Chave: Anti-inflamatórios, Atividade; Fitoquímico; Plantas.

Abstract

The use of anti-inflammatories is increasing every day, however, many of them are formulated with a synthetic base, causing several side effects. With this, we see the importance of using natural products, which have different properties and cause fewer side effects. Among the natural products, Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.)  stands out due to its many beneficial properties, especially the anti-inflammatory effect of its extract. Therefore, the objective of this work was to carry out a literature review on the potent anti-inflammatory activity of the extract of A. chica. To this end, different databases were used, such as SciELO, MEDLINE, PubMed, among others, to select works in different languages. Several studies have shown that anthocyanins, which are flavonoids, present in A. chica make this plant have several properties, in particular, a potent anti-inflammatory activity, by decreasing the production of pro-inflammatory cytokines while increasing the production of the anti-inflammatory cytokine. -inflammatory and immunosuppressive. In addition, studies have also revealed that the extract of this plant has a greater anti-inflammatory effect, confirming what has been described in folk medicine. Therefore, the results obtained in this work stimulate the development of future studies on medicinal plants, especially on A. chica, in order to elucidate the mechanisms of action involved in the identified anti-inflammatory activities, in addition to reinforcing their potent therapeutic actions.

Keywords: Anti-inflammatories, Activity; Phytochemical; Plants.

Introdução

A resposta inflamatória é um dos primeiros mecanismos de proteção da homeostase, envolvendo células e moléculas secretadas, que visam eliminar agentes invasores que causam danos iniciais teciduais, eliminação de células e tecidos necróticos. Embora as inúmeras vantagens ao corpo, quando desregulada torna-se prejudicial para o meio interno e pode ser fatal se perdurar por muito tempo (UBIERA, 2021).

Os principais participantes da inflamação são as células imunes que possuem uma infindável margem de ação biológica e fisiológica, que segue regendo e mediando a interação entre os organismos e o meio externo (SCRIVO et al., 2011; UBIERA, 2021). As células imunes e não imunes podem expressar proteínas de uma família conhecida como Receptores de Reconhecimento de Padrões (do inglês Pattern Recognition Receptors, ou PRRs) que participam ativamente da patogênese de diversas doenças e promovem o início da cascata de eventos da resposta inflamatória (SCRIVO et al., 2011). Os PRRs identificam antígenos não próprios e outras mensagens nocivas ao organismo, sendo assim, possuem finalidade de manter equilíbrio e proteger hospedeiros contra a ampla diversidade de microrganismos aos quais os seres humanos estão expostos (SCRIVO et al., 2011).

Quando um antígeno não-próprio ou um sinal resultante de uma interação patológica atinge o meio interno, passa a ser exposto às estratégias de reconhecimento. Na primeira estratégia, as células e moléculas da imunidade atuam na eliminação de um antígeno reconhecido como não-próprio, na ativação do complemento, fagocitose, netose e degradação proteolítica (GROH et al., 2018).

Por diferentes mecanismos, a imunidade inata tem um papel essencial na montagem da resposta imune, com a participação de moléculas e células, sendo as células centrais os neutrófilos e macrófagos. As moléculas secretadas no processo inflamatório comandam a migração e a resposta das células, dentre elas estão as citocinas, as principais são IL-10 (InterLeucina-10), IL-1β, IL-6 e TNFα (Fator de Necrose Tumoral), que apresentam características anti-inflamatórias e pró-inflamatórias, e diferentes vias de liberação que controlam a secreção dessas moléculas (KIRIPOLSKY; MCCABE; KRAMER, 2017; MESHKANI; VAKILI, 2016).

Existem vastos relatos sobre a gama de aplicações dos produtos naturais devido aos seus efeitos antioxidantes, antibióticos e anti-inflamatórios (KISHORE, et al. 2019; UBIERA, 2021). Além disso, muitas drogas importantes desenvolvidas na medicina moderna foram derivadas de produtos naturais, como a aspirina, quinina, vincristina, vimblastina, dentre outros (PATEL, PATEL, 2017).

O uso terapêutico de plantas ao longo da história baseou-se no conhecimento intuitivo e especulativo dos seres humanos, que aprenderam a diferenciar com o passar do tempo as ervas benéficas daquelas tóxicas à saúde (FERREIRA et al., 2019).  No Brasil, cerca de 82% da população brasileira emprega produtos à base de plantas medicinais nos seus cuidados com a saúde, tanto por meio da medicina tradicional quanto popular, com a transmissão entre gerações, ou até mesmo nos sistemas oficiais de saúde, como prática de cunho científico, orientada pelos princípios e diretrizes do Sistema Único de Saúde (SUS) (BRASIL, 2012; DRESCH; LIBÓRIO; CZERMAINSKI, 2021).

Dentre as plantas medicinais, a Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.) B. Verl. tem se destacado devido às suas diversas propriedades benéficas e ao crescente aumento da sua utilização na medicina tradicional. Como mostrado na Figura 1, de forma geral, essa planta pertence à classe Magnoliopsida e subclasse Asteridae, sendo da família Bignoniaceae e é nativa da Amazônia. A Arrabidaea chica recebe diferentes nomes regionais, como crajiru, capiranga, cajuru, chica, cipó-pau, crajiru, etc. (CORTEZ DE SÁ et al., 2016; JORGE et al., 2008; VASCONCELOS et al., 2019).

 Figura 1: Taxonomia da Arrabidaea chica.

Fonte: IRTIS – REPORTER, 2022.

Apesar de ser uma planta comum na região da Amazônia, é bastante utilizada na medicina popular em diversas regiões brasileiras, tanto por meio de chás e banhos, quanto por compressas de suas folhas, para ajudar na cicatrização de feridas, tratar inflamações, doenças gastrointestinais, leishmanias, enterocolites, anemias e infecções ginecológicas, (SIRAICHI et al., 2013; SANTOS, 2015). Ela também é muito utilizada em rituais, principalmente como corante para pele e árvores (SIRAICHI et al., 2013).

A Arrabidaea chica é rica em antocianinas, que são flavonoides estruturalmente relacionados com a flavona. Os flavonoides são metabólitos secundários encontrados em plantas e frutas coloridas, flores, raízes e folhas com pigmentos hidrossolúveis, os quais são responsáveis pela proteção contra microrganismos e radiação ultravioleta (UV) (MARTÍNEZ; MIJARES; DE SANCTIS, 2019; SPAGNUOLO; MOCCIA; RUSSO, 2018). Esses flavonoides possuem uma potente capacidade anti-inflamatória, antioxidante, anticancerígena e estão associadas à redução do risco cardiovascular (LEE et al., 2017; MARTÍNEZ; MIJARES; DE SANCTIS, 2019; PAULA et al., 2013). Logo, devido à presença desses flavonoides em sua composição, a Arrabidaea chica apresenta um grande efeito anti-inflamatório.

Podem ser obtidos diferentes extratos e frações desta planta, variando apenas o solvente utilizado e o método de preparação. No entanto, devido à construção do conhecimento sobre esta planta nas últimas décadas, sabe-se que o extrato aquoso apresenta atividade anti-inflamatória, por diminuir a produção de citocinas pró-inflamatórias enquanto aumenta a produção da citocina anti-inflamatória e imunossupressora (UBIERA, 2021).

Diante disto, este trabalho tem como objetivo reunir as informações científicas que foram expostas por pesquisas anteriores sobre a atividade anti-inflamatória do extrato da Arrabidaea chica. Para tal, realizou-se uma revisão bibliográfica em diferentes idiomas, bancos de dados e Descritores em Ciências da Saúde (DeCS).

Metodologia

Este trabalho trata-se da revisão integrativa de literatura, que tem como finalidade realizar um levantamento de dados bibliográficos sobre a atividade anti-inflamatória pela presença de flavonoides no extrato da Arrabidaea chica, fazendo uma síntese dos resultados e apresentando conclusões atualizadas acerca da temática.

O processo metodológico do presente trabalho seguiu cinco etapas: 1) formulação da questão de pesquisa; 2) busca na literatura; 3) identificação dos estudos elegíveis; 4) análise crítica dos estudos selecionados; 5) apresentação dos resultados (CROSSETTI, 2012).

A busca na literatura foi realizada nas seguintes bases de dados: Medical Literature Analysis and Retrieval System on-line (MEDLINE), Scientific Electronic Library Online (SciELO), Biblioteca Virtual em Saúde (BVS) e no Banco de Dados de Teses e Dissertações (BDTD). Foram consideradas as seguintes palavras-chaves: “anti-inflamatório”, “plantas medicinais”, “Arrabidaea chica” e “antocianinas”, onde se escolheu os textos disponíveis de forma online nos idiomas: inglês, português e espanhol.  Na seleção foram considerados os seguintes critérios de inclusão: artigos originais, revisões da literatura e relatos de experiência, redigidos em português ou inglês. Foram excluídos os de literatura cinzenta e aqueles que não responderam aos objetivos deste trabalho.

Dessa forma, a seleção dos trabalhos ocorreu, inicialmente, a partir da leitura de títulos e resumos, de acordo com os critérios de elegibilidade descritos anteriormente. Após as análises, selecionou-se os 40 trabalhos mais relevantes para a pesquisa.  Em seguida, foram excluídos 17 dos 40 artigos, pois estes apresentavam duplicidade e/ou não tinham enfoque no tema proposto.

Resultados e Discussão

Uma inflamação aguda quando progride por má resolução, exposição contínua ou prolongada aos desencadeantes nocivos, prolongando-se descontroladamente é definida como inflamação crônica (ALINDA et al., 2018).  Ativados nos últimos estágios da resposta inflamatória normal, as principais células de uma resposta inflamatória crônica são os linfócitos e macrófagos (NATHAN; DING, 2010; SCRIVO et al., 2011; KUMAR, ABUL K. ABBAS, 2013).

O uso de anti-inflamatórios está aumentando mundialmente a cada dia, no entanto, muitos deles são formulados com base sintética para atingir diferentes componentes da cascata inflamatória. Com isso, os anti-inflamatórios causam diversos danos à mucosa gástrica e comprometimento dos néfrons, por tanto essas drogas vêm sendo acompanhadas por seus efeitos adversos proeminentes (KISHORE et al., 2019; LATRUFFE, 2017).

Existem produtos naturais com capacidade de regular a resposta imune através das citocinas, sendo este um dos mecanismos para combater a inflamação, como é o caso da Arrabidaea chica, que têm atividade anti-inflamatória, embora não esteja evidente como esses efeitos são conduzidos molecularmente (HODGE; HODGE; HAN, 2000; PAULA et al., 2013). Essa capacidade se dá principalmente devido a presença de compostos fenólicos, como antocianinas (Figura 2), pertencentes à família dos flavonoides (Figura 2) (PAULA et al., 2013). Estudos farmacológicos destacam o alto poder antioxidante das antocianinas em doenças metabólicas, dentre as quais podemos destacar a atividade anti-inflamatória e anticâncer (ZAFRA‐STONE et al., 2007; TAFFARELLO, et al., 2013).

Os flavonoides são conhecidos por sua capacidade de sequestrar radicais livres in vivo e in vitro e pelas propriedades de estabilização da membrana celular (ADEDAPO et al., 2008). Como apresentado na Figura 2, quimicamente, essas substâncias caracterizam-se por apresentarem em seu esqueleto básico 15 carbonos, com dois anéis benzênicos aromáticos unidos por uma ponte de três átomos de carbono, que pode ou não formar um terceiro anel (Figura 2) (LOPES et al., 2010; KALLEGARI, 2009). Os flavonoides naturais têm pelo menos três hidroxilas fenólicas e são encontrados geralmente combinados com açúcares na forma de glicosídeos, embora também ocorram com relativa frequência como agliconas livres (LOPES et al., 2010; OLLIS, 2013). Vários subgrupos de flavonoides são classificados conforme a substituição do anel C (Figura 2).

Como apresentado na Figura 2, as antocianinas apresentam estruturas muito similares a dos flavonoides, sendo antocianidinas encontradas na sua forma glicosada (ligadas a uma porção de açúcar). Elas consistem em um anel aromático (A) ligado a um anel heterocíclico (C) que contém um átomo de oxigênio, o qual é também ligado, por uma ligação carbono-carbono, a um terceiro anel aromático (B) (SANTOS, 2015). Na figura 3 é possível verificar as classes de flavonoides conhecidas e suas respectivas subclasses além de identificar as inúmeras fontes naturais de cada uma destas moléculas tão importantes para a saúde.

Figura 2: Estrutura esquelética básica geral de um flavonoide e de suas classes entre elas as antocianinas. Fonte: PANCHE; DIWAN; CHANDRA, 2016, licença CC BY 4.0.

Figura 3: Classes, subclasses e fontes naturais de flavonoides.

Fonte: PANCHE; DIWAN; CHANDRA, 2016, licença CC BY 4.0.

As folhas de Arrabidaea chica são ricas em três antocianinas do tipo 3-desoxi antocianinas, as quais são responsáveis pelas propriedades de coloração dessa planta (PAULA et al., 2013). A fórmula estrutural dessas três antocianinas está apresentada na Figura 4 – A – B – C. Dentre essas antocianinas encontradas na Arrabidaea chica destaca-se a 6,7-dihidroxi-5,4′- dimetoxi-flavilium, popularmente conhecido como carajurina (Figura 4 – C), por ser o principal pigmento dessa planta. A Carajurina foi o primeiro composto isolado da Arrabidaea chica durante estudos das folhas dessa planta realizados por Chapman et al. (1927). Anos depois, sua fórmula molecular foi determinada como 6,7-dihidroxi-5,4′- dimetoxi-flavilium (ZORN et al., 2001), cuja fórmula estrutural está apresentada na Figura 4 – C.

Os flavonoides presentes na Arrabidaea chica têm sido considerados como responsáveis por várias atividades desta planta, inclusive a atividade anti-inflamatória (ALCARAZ, HOLUT, 1985; MORS et al., 2000). A atividade anti-inflamatória desta planta vem sendo observada in vitro, in vivo e relatadas nas crenças populares dos povos amazônicos (BRUNETTI et al, 2013).

Figura 4: Fórmula estrutural das principais antocianinas presentes na Arrabidaea chica: (a) 6,7,3’,4’-tetrahidroxi-5-metoxi-flavilium; (b) 6,7,4’-trihidroxi-5-metoxi-flavilium (Carajurona); (c) 6,7-dihidroxi-5,4’-dimetoxi-flavilium (Carajurina).

A                                                                               

B

C

Fonte:.

PubChem [Internet]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), National Center for Biotechnology Information; 2004-. PubChem Compound Summary for CID 44257042, 6,7,3′,4′-Tetrahydroxy-5-methoxy-flavylium; [cited 2022 June 22]. Available from: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/6_7_3_4_-Tetrahydroxy-5-methoxy-flavylium

PubChem [Internet]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), National Center for Biotechnology Information; 2004-. PubChem Compound Summary for CID 44257041, 6,7,4′-Trihydroxy-5-methoxy-flavylium; [cited 2022 June 22]. Available from: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/6_7_4_-Trihydroxy-5-methoxy-flavylium

PubChem [Internet]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), National Center for Biotechnology Information; 2004-. PubChem Compound Summary for CID 44257040, 6,7-Dihydroxy-5,4′-dimethoxy-flavylium; [cited 2022 June 22]. Available from: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/6_7-Dihydroxy-5_4_-dimethoxy-flavylium

Em estudos realizados por Oliveira et al. (2008), foi investigado em camundongos albinos o efeito anti-inflamatório do extrato aquoso da Arrabidaea chica sobre o edema induzido por venenos de serpentes amazônicas dos gêneros Brothrops e Crotalus, por via oral, intraperitoneal e subcutânea. Para o gênero Bothrops, o efeito inibitório pelas vias subcutânea e intraperitoneal (12 horas) foi de 55,87% e 65,70%, respectivamente. No gênero Crotalus o efeito inibitório do extrato pela via subcutânea após 3 horas foi de 33,55% e após 6 horas de 79,81%, na via intraperitoneal após 3 horas foi de 48,02% e após 6 horas de 92,52%. Na realização da análise histopatológica, os efeitos inflamatórios inibidos mais significativamente foram o infiltrado de granulócitos e a miocitólise (OLIVEIRA et al., 2008).

Os resultados obtidos por Oliveira et al. (2008) sugerem, portanto, a presença de substâncias no extrato aquoso de Arrabidaea chica que são capazes de inibir as toxinas dos venenos das serpentes Bothrops atrox e Crotalus durissus ruruima, que induzem o processo inflamatório. Ou ainda substâncias no extrato capazes de inibir fatores endógenos que estimulam os processos pró-inflamatórios sobre os efeitos inflamatórios.  Porém, o extrato não apresenta efeito anti-inflamatório em nenhuma das doses testadas pela via oral (OLIVEIRA et al., 2008).

Pesquisas realizadas por Zorn et al. (2001) também revelaram que o extrato da Arrabidaea chica inibe o fator nuclear kappa B (NF-κB). Essa inibição interfere na expressão de genes cujos produtos mediam as respostas imune e inflamatória (ZORN et al., 2001). O NF-κB atua em genes pró-inflamatórios gerando mediadores da inflamação e moléculas de adesão importantes para o recrutamento de leucócitos, no local da inflamação (BARNES; KARIN, 1997). Dentre os leucócitos, os neutrófilos desempenham um papel importante na angiogênese pela liberação de quimiocinas que causam a invasão de células endoteliais e formação de vasos sanguíneos (ALBINI et al., 2005). Sendo assim, quanto menor a migração de neutrófilos, maior a inibição do NF-κB e consequentemente a expressão do gene para o fator de necrose tumoral-α (TNFα) importante para o recrutamento e ativação de neutrófilos (ZORN et al., 2001).

Estudos in vivo realizados por Takemura et al. (1995), testaram em neutrófilos de coelho a atividade anti-inflamatória da luteolina isolada do extrato da Arrabidaea chica. Os neutrófilos estimulados, geram espécies reativas de oxigênio (ROS) quase exclusivamente pelo NADPH oxidase, formado na membrana do fagolisossomo e o produto desta reação é o superóxido, que pode ser convertido em outros metabólitos, incluindo peróxido de hidrogênio e ácido hipocloroso (LEE; HARRISON; GRINSTEIN, 2003; MAYER-SCHOLL, 2004). A luteolina apresentou alta atividade de inibição da liberação de enzimas e produção de superóxido por neutrófilos estimulados por peptídeo formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (FMLP), que ativa a NADPH oxidase (FILHO, 2006).

Em pesquisas recentes realizadas por Ubiera (2021), observou-se que a produção da IL-10 nos macrófagos que foram pré-incubados com o extrato aquoso de Arrabidaea chica, aumentou a produção de IL-10, que foi maior que a estimulada pelo próprio LPS. Pelas propriedades imunomoduladoras e anti-inflamatórias da IL-10 pode-se explicar a capacidade anti-inflamatória do Arrabidaea chica (UBIERA, 2021). A IL-10 é uma das mais importantes citocinas anti-inflamatórias e a principal na manutenção da homeostase imunológica, sendo secretada principalmente pelos macrófagos (MANNINO et al., 2015). Nos macrófagos, sua síntese é regulada por diferentes mecanismos, sendo um deles o sistema purinérgico, ativado no estresse metabólico, representado pela adenosina que é um nucleosídeo sinalizador (Figura 4) (SARAIVA; O’GARRA, 2010).

Como apresentado na Figura 4, a síntese extracelular, segue a partir da desfosforilação da adenosina trifosfato (do inglês, Adenosine Triphosphate, ou ATP) devido à ação das endo e ectonucleotidases, o ATP sai das células principalmente pelos canais de pannexin, mas também há liberação vesicular de ATP. No espaço extracelular, o ATP é convertido no monofosfato de adenosina (do inglês, Adenosine Monophosphate, ou AMP) pela ação do trifosfato de ectonucleósido difosfo-hidrolase-1 (CD39) na membrana extracelular, sendo posteriormente convertido em adenosina pela ecto-5′-nucleotidase (CD79) (UBIERA,2021).

Figura 4: Esquema que mostra a interação do extrato aquoso da Arrabidaea Chica VERLOT com as células, aumentando a taxa na qual o ATP extracelular é convertido em adenosina para parecer ainda mais na membrana citoplasmática e aumentar a produção da citocina anti-inflamatória IL-10.

Fonte: Ubiera, 2021, licença CC BY-NC-ND 4.0.

A adenosina pode sofrer os efeitos da enzima adenosina desaminase (ADA), que converte adenosina em inosina, a qual posteriormente se torna ácido úrico e é eliminada pelos rins (KUMAR; SHARMA, 2009). Os receptores de adenosina são um dos pontos essenciais da via, pois sem eles, a adenosina não pode ser reconhecida pela célula. Evidenciando que o receptor A2_A é essencial para os efeitos anti-inflamatórios de Arrabidaea chica e a participação de A2_B receptor apresentam um efeito importante neste fenômeno (UBIERA, 2021).

            Portanto, os estudos apresentados indicaram que, de fato, a Arrabidaea chica tem potentes efeitos anti-inflamatórios, especialmente no seu extrato.

Considerações Finais

A Arrabidaea chica está dentre as várias espécies de plantas empregadas na medicina tradicional. A ocorrência expressiva de flavonoides, como as antocianinas, especialmente a Carajurina, explica em grande medida a ampla gama de ações terapêuticas desta espécie. Dentre as ações terapêuticas dessa planta destaca-se a aceleração de cicatrização de feridas, no tratamento de doenças gastrointestinais, leishmanias, enterocolites, anemias e infecções ginecológicas e, especialmente, a atividade anti-inflamatória.

A atividade imunofarmacológica testada pelos autores nesta revisão de literatura, permitiu evidenciar o grande potencial terapêutico de A. chica, confirmando a atividade anti-inflamatória, descrita no uso popular dessa planta.  Os experimentos realizados pelas pesquisas citadas também sugerem a atividade imunorreguladora para os constituintes químicos desta espécie. Entretanto, é necessário garantir a eficácia e segurança da planta medicinal com o uso para a constância de sua qualidade. A validação científica poderá contribuir para a redução dos custos no sistema público de saúde mediante o emprego racional e seguro de insumos e produtos desta espécie vegetal.

Portanto, os resultados obtidos neste estudo estimulam o desenvolvimento de futuros trabalhos e a realização de novos estudos sobre plantas medicinais, especialmente sobre a A. chica, a fim de elucidar os mecanismos de ação envolvidos nas atividades anti-inflamatória identificadas. Além disso, esse estudo reforça as potentes ações terapêuticas e anti-inflamatórias da A. chica,

Referências

ALBINI, A. et al. Tumor inflammatory angiogenesis and its chemoprevention. Cancer research, v. 65, n. 23, p. 10637-10641, 2005.

ALCARAZ, M. J.; HOULT, J. R. S. Actions of flavonoids and the novel anti-inflammatory flavone, hypolaetin-8-glucoside, on prostaglandin biosynthesis and inactivation. Biochemical pharmacology, v. 34, n. 14, p. 2477-2482, 1985.

BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção à Saúde. Departamento de Atenção Básica. Práticas integrativas e complementares: plantas medicinais e fitoterapia na Atenção Básica/Ministério da Saúde. Brasília: Ministério da Saúde, 2012.

BRUNETTI, C. et al. Flavonoids as antioxidants and developmental regulators: relative significance in plants and humans. International journal of molecular sciences, v. 14, n. 2, p. 3540-3555, 2013.

DRESCH, R. R.; LIBÓRIO, Y. B.; CZERMAINSKI, S. B. C. Compilação de levantamentos de uso de plantas medicinais no Rio Grande do Sul. Physis: Revista de Saúde Coletiva, v. 31, p. e310219, 2021.

CORTEZ DE SÁ, J. et al. Leishmanicidal, cytotoxicity and wound healing potential of Arrabidaea chica Verlot. BMC Complementary and alternative medicine, v. 16, n. 1, p. 1-11, 2015.

CROSSETTI, Maria da Graça Oliveira. Revisão integrativa de pesquisa na enfermagem o rigor científico que lhe é exigido. Revista gaúcha de enfermagem, v. 33, n. 2, p. 8-9, 2012.

FERREIRA, E. T. et al. A utilização de plantas medicinais e fitoterápicos: uma revisão integrativa sobre a atuação do enfermeiro. Brazilian Journal of Health Review, v. 2, n. 3, p. 1511-1523, 2019.

FILHO, G. B. Bogliolo – Patologia. 7 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006.

GROH, L. et al. Monocyte and macrophage immunometabolism in atherosclerosis. In: Seminars in immunopathology. Springer Berlin Heidelberg, 2018. p. 203-214.

HODGE, G.; HODGE, S.; HAN, P. Increased levels of apoptosis of leukocyte subsets in cultured PBMCs compared to whole blood as shown by Annexin V binding: relevance to cytokine production. Cytokine, v. 12, n. 12, p. 1763-1768, 2000.

IRTIS – REPORTER. Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.) Verl.  Taxonomic Serial No.: 34330. 2022. Disponivel em: https://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=34330#null. Acesso em: 20 de março de 2022.

JORGE, M. P. et al. Evaluation of wound healing properties of Arrabidaea chica Verlot extract. Journal of Ethnopharmacology, v. 118, n. 3, p. 361-366, 2008.

KALEGARI, M. Composição fitoquímica e atividades biológicas de Rourea induta Planch, Connaraceae. 2009. 119 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Paraná, Curitiba/PR.

KIRIPOLSKY, J.; MCCABE, L. G.; KRAMER, Jill M. Innate immunity in Sjögren’s syndrome. Clinical immunology, v. 182, p. 4-13, 2017.

KISHORE, N. et al. Human disorders associated with inflammation and the evolving role of natural products to overcome. European journal of medicinal chemistry, v. 179, p. 272-309, 2019.

KUMAR, V. et al. Robbins patologia básica. Elsevier Brasil, 2013.

KUMAR, V.; SHARMA, A. Adenosine: an endogenous modulator of innate immune system with therapeutic potential. European journal of pharmacology, v. 616, n. 1-3, p. 7-15, 2009.

LATRUFFE, N. Natural products and inflammation. Molecules, v. 22, n. 1, p. 120, 2017.

LEE, Y. et al. Dietary anthocyanins against obesity and inflammation. Nutrients, v. 9, n. 10, p. 1089, 2017.

LEE, W. L.; HARRISON, R. E.; GRINSTEIN, Sergio. Phagocytosis by neutrophils. Microbes and infection, v. 5, n. 14, p. 1299-1306, 2003.

LOPES, R. M. et al. Flavonoides. Biotecnologia Ciência& Desenvolvimento, v. 3, n. 14, p. 18-22, 2010.

MANNINO, M. H. et al. The paradoxical role of IL-10 in immunity and cancer. Cancer letters, v. 367, n. 2, p. 103-107, 2015.

MARTÍNEZ, G.; MIJARES, M. R.; DE SANCTIS, J. B. Effects of flavonoids and its derivatives on immune cell responses. Recent patents on inflammation & allergy drug discovery, v. 13, n. 2, p. 84-104, 2019.

MAYER-SCHOLL, A.; AVERHOFF, P.; ZYCHLINSKY, A. How do neutrophils and pathogens interact?. Current opinion in microbiology, v. 7, n. 1, p. 62-66, 2004.

MEDZHITOV, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature, v. 454, n. 7203, p. 428-435, 2008.

MESHKANI, R.; VAKILI, S. Tissue resident macrophages: Key players in the pathogenesis of type 2 diabetes and its complications. Clinica chimica acta, v. 462, p. 77-89, 2016.

MORS, W. B.; RIZZINI, C. T.; PEREIRA, N. A. Medicinal plants of Brazil. Reference Publications, Inc. 2000.

NATHAN, C.; DING, A. Nonresolving inflammation. Cell, v. 140, n. 6, p. 871-882, 2010.

OLLIS, W. David (Ed.). Recent Developments in the Chemistry of Natural Phenolic Compounds: Proceedings of the Plant Phenolics Group Symposium. Elsevier, 2013.

Panche, A.N.; Diwan, A.D.; Chandra, S.R. Flavonoids: an overview. J Nutr Sci. v.5: e47, 2016, doi: 10.1017/jns.2016.41

PATEL, K.; PATEL, D. K. Medicinal importance, pharmacological activities, and analytical aspects of hispidulin: A concise report. Journal of traditional and complementary medicine, v. 7, n. 3, p. 360-366, 2017.

PAULA, J. T. et al. Extraction of anthocyanins from Arrabidaea chica in fixed bed using CO2 and CO2/ethanol/water mixtures as solvents. The Journal of Supercritical Fluids, v. 81, p. 33-41, 2013.

SANTOS, R. P. Extração, caracterização e avaliação bioativa do extrato de Arrabidaea chica. 2015. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2015.

SARAIVA, M.; O’GARRA, A. The regulation of IL-10 production by immune cells. Nature reviews immunology, v. 10, n. 3, p. 170-181, 2010.

SCRIVO, R. et al. Inflammation as “common soil” of the multifactorial diseases. Autoimmunity reviews, v. 10, n. 7, p. 369-374, 2011.

SIRAICHI, J. T. G. et al. Antioxidant capacity of the leaf extract obtained from Arrabidaea chica cultivated in Southern Brazil. PLoS One, v. 8, n. 8, p. e72733, 2013.

SPAGNUOLO, C.; MOCCIA, S.; RUSSO, G. L. Anti-inflammatory effects of flavonoids in neurodegenerative disorders. European journal of medicinal chemistry, v. 153, p. 105-115, 2018.

TAFFARELLO, D. et al. Atividade de extratos de Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.) Verlot obtidos por processos biotecnológicos sobre a proliferação de fibroblastos e células tumorais humanas. Química Nova, v. 36, p. 431-436, 2013.

TAKEMURA, O. S. et al. A flavone from leaves of Arrabidaea chica f. cuprea. Phytochemistry, v. 38, n. 5, p. 1299-1300, 1995.

UBIERA, R. D. Adenosine Dependent Anti-Inflammatory Effects of Arrabidaea Chica VERLOT. 2021. 80 f. Tese (Doutorado em Imunologia Básica e Aplicada) – Universidade Federal do Amazonas, Manaus, 2021.

VASCONCELOS, C. C. et al. Effects of extract of Arrabidaea chica Verlot on an experimental model of osteoarthritis. International Journal of Molecular Sciences, v. 20, n. 19, p. 4717, 2019.

ZAFRA‐STONE, S. et al. Berry anthocyanins as novel antioxidants in human health and disease prevention. Molecular nutrition & food research, v. 51, n. 6, p. 675-683, 2007.

ZORN, B. et al. 3-Desoxyanthocyanidins from Arrabidaea chica. Phytochemistry, v. 56, n. 8, p. 831–835, 2001.

CAPÍTULO 5

OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE COCRISTAIS FARMACÊUTICOS: UMA REVISÃO SOBRE A COMPLEXIDADE DESSA ABORDAGEM

ACQUISITION AND CHARACTERIZATION OF PHARMACEUTICAL COCRYSTALS: A REVIEW ON THE COMPLEXITY OF THIS APPROACH

DOI: https://doi.org/10.56001/22.9786500466386.05

Submetido em: 04/01/2024

Revisado em: 16/01/2024

Publicado em: 25/01/2024

Isabela Fanelli Barreto Biscaia

Universidade Estadual do Centro Oeste, Departamento de Farmácia, Guarapuava-PR

http://lattes.cnpq.br/4913569775975331

Patrícia Bubna Biscaia

Universidade Estadual de Ponta Grossa, Departamento de Farmácia, Ponta Grossa-PR

http://lattes.cnpq.br/9373722894116587

Luiza Stolz Cruz

Universidade Estadual do Centro Oeste, Departamento de Farmácia, Guarapuava-PR

http://lattes.cnpq.br/1794921152056259

Camila Nogueira Pacentchuk

Universidade Estadual do Centro Oeste, Departamento de Farmácia, Guarapuava-PR

http://lattes.cnpq.br/2703438736320965

Samantha Nascimento Gomes

Universidade Estadual do Centro Oeste, Departamento de Farmácia, Guarapuava-PR

http://lattes.cnpq.br/0069997200153496

Larissa Sakis Bernardi

Universidade Estadual do Centro Oeste, Departamento de Farmácia, Guarapuava-PR

http://lattes.cnpq.br/4786154799567952

Paulo Renato de Oliveira

Universidade Estadual do Centro Oeste, Departamento de Farmácia, Guarapuava-PR

http://lattes.cnpq.br/3167101952781896

Resumo

As moléculas com solubilidade aquosa limitada têm sido alvo de diversas pesquisas, pois apresentam dissolução lenta em fluídos biológicos e absorção gastrointestinal limitada, o que compromete as aplicações clínicas dos medicamentos. A formação de cocristais é um método confiável para melhorar propriedades como solubilidade e estabilidade, sem modificar sua ação. Os cocristais são materiais cristalinos estruturalmente homogêneos, formados por, no mínimo, dois compostos neutros que se encontram em quantidades estequiométricas definidas e são sólidos à temperatura ambiente. Um cocristal farmacêutico é composto por um ingrediente farmacêutico ativo (IFA) e por um coformador, que pode ser outro fármaco ou uma molécula não tóxica. Eles podem ser produzidos por diferentes técnicas, como mecanoquímica, evaporação do solvente, método de cristalização por reação, entre outros. Sua caracterização é indispensável para confirmar a nova estrutura cristalina, e é feita por meio de técnicas de caracterização do estado sólido. Os cocristais aumentam a solubilidade de fármacos ao fornecer supersaturação, estado termodinamicamente metaestável. A presença de polímeros prolonga o estado de supersaturação, inibindo a precipitação do fármaco. Os estudos de dissolução não-sink são os mais relevantes para avaliar a dissolução de sistemas supersaturados de liberação de fármaco, do inglês “Supersaturating Drug Delivery Systems” (SDDS), pois estimam a formação e manutenção do estado supersaturado, entretanto os cocristais também podem ser avaliados por métodos termodinâmicos, no qual um estado de equilíbrio entre o fármaco e o coformador é alcançado.

Palavras-Chave: cocristal, solubilidade, fármaco, caracterização.

Abstract

Molecules with limited aqueous solubility have been the focus of numerous studies as they exhibit slow dissolution in biological fluids and limited gastrointestinal absorption, compromising the clinical applications of drugs. The formation of cocrystals is a reliable method to enhance properties such as solubility and stability without altering their action. Cocrystals are structurally homogeneous crystalline materials formed by at least two neutral compounds in defined stoichiometric quantities and are solid at room temperature. A pharmaceutical cocrystal comprises an active pharmaceutical ingredient (API) and a coformer, which can be another drug or a non-toxic molecule. They can be produced by various techniques such as mechanochemistry, solvent evaporation, reaction crystallization method, among others. Characterization is indispensable to confirm the new crystalline structure and is carried out through solid-state characterization techniques. Cocrystals enhance drug solubility by providing supersaturation, a thermodynamically metastable state. The presence of polymers extends the state of supersaturation, inhibiting drug precipitation. Dissolution studies under non-sink conditions are the most relevant for evaluating the dissolution of supersaturated drug delivery systems (SDDS), as they estimate the formation and maintenance of the supersaturated state. However, cocrystals can also be evaluated by thermodynamic methods, in which an equilibrium state between the drug and the coformer is achieved.

Keywords: cocrystal, solubility, drug, characterization.

Introdução

Os fármacos pertencentes à classe II do SCB Sistema de Classificação Biofarmacêutica, desenvolvido por Amidon e colaboradores em 1995, representam mais de 30% dos medicamentos comercializados. Esses fármacos correm o risco de serem retirados do desenvolvimento de medicamentos devido à sua fraca solubilidade aquosa (ALHALAWEH et al., 2012). Portanto, é fundamental desenvolver estratégias que aumentem a solubilidade desses fármacos.

O aprimoramento das propriedades essenciais de um Ingrediente Farmacêutico Ativo (IFA) – por exemplo: biodisponibilidade, solubilidade, propriedades de fluxo e estabilidade térmica – são essenciais para novos desenvolvimentos tecnológicos na indústria farmacêutica (CERREIA VIOGLIO; CHIEROTTI; GOBETTO, 2017). Fármacos com solubilidade aquosa limitada apresentam dissolução lenta em fluidos biológicos e, consequentemente, exposição sistêmica insuficiente e eficácia reduzida (BLAGDEN et al., 2007; GUO et al., 2021).

O desenvolvimento de novas formulações farmacêuticas visa melhorar o manuseio de ingredientes durante o processamento, melhorar a estabilidade e aumentar a dissolução de fármacos (IZUTSU et al., 2016). Alterações químicas, como modificação de ligações covalentes, são muito comuns em moléculas no estado sólido, pois permitem alterações nas propriedades físicas de um fármaco sem alterar seu mecanismo de ação (BERRY; STEED, 2017).

A adição de um segundo componente à formulação, gerando um sal ou cocristal, é capaz de alterar as propriedades do IFA (BERGE; BIGHLEY; MONKHOUSE, 1977). No entanto, a necessidade de que o fármaco possua um grupo ácido ou básico ionizável limita a formação dos sais, enquanto os cocristais não necessitam tais grupos, pois formam compostos a partir de interações reversíveis e não covalentes (SCHULTHEISS; NEWMAN, 2009). Nos últimos anos, a percepção da engenharia farmacêutica dos cocristais ganhou grande visibilidade (DOUROUMIS; ROSS; NOKHODCHI, 2017) e houve aumento do interesse pelos cocristais farmacêuticos, que representam um método robusto para aumento da solubilidade de fármacos pouco solúveis (QIAO et al., 2011).

Metodologia

Este capítulo apresenta uma abordagem de pesquisa qualitativa com características descritivas e explicativas. O levantamento bibliográfico foi conduzido por meio da busca, obtenção e análise de documentos, avaliando o conteúdo de materiais relevantes para contextualizar e embasar o tema desta pesquisa. A revisão da literatura abrangeu fontes renomadas, como Pubmed, Scielo, Mendeley e Google Acadêmico, utilizando termos-chave específicos: “Cocristais”, “Cocristais farmacêuticos”, “métodos de obtenção de cocristais” e “métodos de caracterização de cocristais”.

Resultados e Discussão

Os cocristais são compostos orgânicos que contêm duas ou mais moléculas orgânicas neutras, sólidas à temperatura ambiente (AAKERÖY; SALMON, 2005), em quantidades estequiométricas dentro da mesma rede cristalina (QIAO et al., 2011). Eles são compostos por um IFA e um agente cocristalizador (coformador), tipicamente um composto orgânico (BATZDORF et al., 2017), que pode ser outro fármaco ou uma molécula não tóxica (QIAO et al., 2011). São utilizados para melhorar a solubilidade, taxa de dissolução in vitro e biodisponibilidade de fármacos pouco solúveis (MCNAMARA et al., 2006), podendo aumentar sua solubilidade em até 100 vezes ou mais (BAGHEL et al., 2009). De acordo com a Tabela 1, alguns medicamentos já comercializados, contêm cocristais na formulação, o que demonstra o interesse da indústria farmacêutica por essa estratégia de desenvolvimento de novos sólidos cristalinos (KAVANAGH et al., 2019).

Entre as vantagens dos cocristais estão: design que não requer um grupo funcional específico para sua composição, metodologia acessível, a capacidade de alterar as formas cristalinas de um fármaco e o desenvolvimento de novas formas de cristal, que podem ser patenteadas como novos medicamentos (SHANG; ZAWOROTKO, 2008). Em comparação com o sal, que é obtido pela adição de um segundo componente à rede cristalina (BERGE; BIGHLEY; MONKHOUSE, 1977), os cocristais tem a vantagem de não requerer um grupo básico ou ácido ionizável, pois são formados a partir de ligações de hidrogênio (SCHULTHEISS; NEWMAN, 2009).

Tabela 1: Produtos comercializados que possuem cocristais.

As interações entre o IFA e o coformador são baseadas em complementaridade molecular e podem ocorrer por interações entre dois grupos funcionais iguais (homosynthons): ácido carboxílico-ácido carboxílico (Figura 1, a) e amida-amida (Figura 1, b)  (AAKERÖY; SALMON, 2005); ou por interações entre dois grupos funcionais diferentes (heterosynthons): ácido carboxílico-nitrogênio aromático (Figura 1, c), ácido carboxílico-amida (Figura 1, d)  e álcool-piridina (Figura 1, e)  (DOUROUMIS; ROSS; NOKHODCHI, 2017).

Figura 1: Ligações de hidrogênio entre grupos funcionais que formam cocristais. a) ácido carboxílico-ácido carboxílico, b) amida-amida, c) ácido carboxílico-nitrogênio aromático d) ácido carboxílico-amida, e) álcool-piridina.

Como os cocristais têm um grande potencial para a indústria farmacêutica (BRITTAIN, 2013), o centro de pesquisa e avaliação da FDA emitiu uma orientação para a indústria sobre a classificação regulatória de cocristais farmacêuticos (FDA, 2013). Neste documento, o FDA define cocristais como sólidos cristalinos compostos por duas ou mais moléculas na mesma rede cristalina, sendo um complexo molecular dissociável de IFA-excipiente, onde o coformador é o excipiente. A fim de provar a existência do cocristal, a FDA exige evidências de que tanto o IFA como o coformador existam em seus estados neutros e que nenhuma interação iônica foi usada para associar as duas substâncias.

A European Medicines Agency (EMA) também produziu um documento de discussão sobre o uso de cocristais em produtos medicinais, definindo-os como ferramentas versáteis, utilizadas para obtenção de melhores propriedades de estado sólido. O documento define os cocristais como estruturas cristalinas homogêneas constituídas por dois ou mais componentes em uma relação estequiométrica definitiva, onde o arranjo na rede cristalina não é baseado em ligações iônicas e requer que a formação do cocristal seja demonstrada por meio de técnicas analíticas adequadas (EMA, 2014).

A ANVISA, emitiu uma nota técnica em fevereiro de 2017 intitulado “Registro de medicamentos novos, genéricos e similares contendo solvatos e cocristais como insumo farmacêutico ativo” (ANVISA, 2017). Este documento afirma que o cocristal: deve ser tratado como um IFA; deve ser caracterizado quimicamente; deve ser colocada a equivalência da base livre na bula e na rotulagem do medicamento; e deve ter a estequiometria definida e controlada por meio de de testes de controle de qualidade.

A formação do cocristal é caracterizada como a cristalização de uma única fase, em uma razão estequiométrica, de acordo com a seguinte reação de equilíbrio para um cocristal binário AyBz (KUMINEK et al., 2016a; RODRÍGUEZ-HORNEDO et al., 2006a):

(AyBz)sólido  yAsolução + zBsolução                                      Equação 1

onde A e B representam fármaco e coformador, e z e y representam seus respectivos coeficientes estequiométricos. A reação descreve a formação do cocristal (da direita para a esquerda) e a dissolução (da esquerda para a direita).

O produto de solubilidade (Ksp) é a constante de equilíbrio termodinâmico da reação e é dado pelo produto dos coeficientes de atividade (γ) dos componentes A e B multiplicados pelas concentrações dos componentes (KUMINEK et al., 2016a)

Ksp,a= γA[A]y γB[B]z ≈ Ksp= [A]y [B]z                                        Equação 2

onde [A] e [B] são as concentrações molares de cada componente cocristal em equilíbrio. Em condições ideais, γ é igual a 1 e o produto de solubilidade baseado na atividade é substituído pelo produto de concentração Ksp.

Agente cocristalizador (coformador)

A escolha do coformador é de grande importância para a formação do cocristal, pois este deve apresentar-se seguro em relação à sua toxicidade, ser altamente solúvel, e possuir regiões de complementaridade molecular com o fármaco (KUMAR; NANDA, 2021). A interação fármaco:coformador nos cocristais compreende especialmente as ligações de hidrogênio intermoleculares, contudo, interações de Van der Waals, empilhamento π e ligações de halogênio também se demonstram significativas (ROCHA et al., 2016). Existem diversos materiais sólidos reconhecidos como seguros pelo GRAS (Generally Recognized as Safe) do FDA, dentre eles, aditivos alimentares e outras substâncias. Quantidades subterapêuticas de fármacos como paracetamol e ácido acetilsalicílico também podem ser utilizadas como coformadores.

Além de interações baseadas em complementaridade molecular, a estereoquímica dos componentes e características intrínsecas do fármaco, como a polaridade e o pKa, também devem ser considerados durante a seleção do coformador para a síntese do cocristal.   Para reações em solução, ΔpKa < 0 indica a formação de um cocristal, enquanto que ΔpKa > 3 designa a produção de um sal, enquanto que na região de ΔpKa entre 0 e 3, a previsão do material resultante é limitada (JOHNSON; RUMON, 1965).

A seleção do coformador modula a solubilidade aquosa do cocristal, pois este qual pode reduzir a barreira de solvatação em uma extensão proporcional à sua solubilidade. Dependendo de quão solúvel o coformador é, a razão da solubilidade do cocristal pode variar em relação ao fármaco (GOOD; RODRÍGUEZ-HORNEDO, 2010; KUMINEK et al., 2016b).

Métodos de obtenção de cocristais

Várias estratégias foram relatadas por pesquisadores para preparar cocristais (AAKERÖY; SALMON, 2005). Uma técnica clássica para a obtenção de cocristais é a cristalização em solução. Este método é realizado com um solvente adequado em que todos os componentes são solúveis, o que promove a formação dos cocristais. Quantidades estequiométricas dos componentes são dissolvidas em um solvente, que pode ser aquecido para facilitar a dissolução e, em seguida, evaporado (ROCHA et al., 2016). Uma das desvantagens do método é o grande número de possíveis solventes, o que requer vários experimentos de triagem (TRASK et al., 2005).

Outra abordagem é a técnica solvo-térmica, onde a supersaturação do cocristal ocorre por meio de mudanças de temperatura (YU et al., 2011; YU; CHOW; TAN, 2010). Para este método obter sucesso, é necessária uma triagem de solvente, na qual as substâncias possuem solubilidades a fim de minimizar a cristalização individual (KUMINEK et al., 2016a).

O método anti-solvente também pode ser utilizado, no qual um solvente, em que o composto é menos solúvel, é adicionado a outra solução, gerando supersaturação e favorecendo a precipitação de sólidos (OBER; GUPTA, 2012).

Na metodologia de mecanoquímica, a cristalização ocorre através da ativação mecânica por moagem. Este método pode reduzir a triagem (TRASK; JONES, 2005) e é capaz de gerar cocristais que não são possíveis por meio de solução (ETTER; ADSMOND, 1990). A eficiência da cocristalização por moagem pode ser melhorada pela adição de pequenas quantidades de solventes (SHAN; JONES, 2003), que leva à formação do cocristal por alteração das interações em solução, e possibilita maior rendimento e grau de cristalinidade do que a moagem simples (WOUTERS; QUERE, 2011).

A formação de cocristais pelo método de fusão, também conhecida como técnica de Kofler, consiste em fusão simultânea de dois compostos em uma lâmina, seguida de solidificação. Este procedimento gera um complexo molecular com ambos os componentes, que sob condições apropriadas forma o cocristal (BERRY et al., 2008; STAHLY, 2007).

Também é possível sintetizar cocristais através do Sonic Slurry™(CHILDS; MOUGIN; STAHLY, 2005), uma técnica de alto rendimento, realizada em placas de poços (CHILDS et al., 2008). É realizada a dispersão de partículas sólidas em uma fase líquida que compreende um ou mais solventes em que a substância química não é completamente solúvel. Em seguida, a pasta de reagentes é submetida a pulsos de ultrassom que aceleraram a formação de cocristais (APSHINGEKAR et al., 2017; FRISCIC et al., 2009).

Existe também um método baseado em calor que não utiliza solvente: o método de extrusão de fusão à quente. O calor utilizado permite que apenas a matriz seja derretida, e utiliza um agente catalítico para melhorar a formação de cocristais. A desvantagem desta metodologia é que não pode ser utilizado para substâncias termicamente instáveis (CROWLEY et al., 2007).

O aquecimento também é utilizado na técnica de secagem por pulverização, um método que transforma um líquido em uma substância seca pela utilização de gás e temperaturas elevadas. O processo é vantajoso porque é contínuo, controlável e rápido (VEHRING, 2008).

Enquanto, a técnica de cocristalização de solvente supercrítico é baseada no poder solvente de CO2 supercrítico. Primeiramente o IFA e o coformador são dissolvidos, e em seguida a solução é despressurizada rapidamente, diminuindo o poder do solvente e produzindo supersaturação, o que leva à cristalização. A desvantagem do processo é o baixo rendimento (PADRELA et al., 2015).

O método de cristalização por reação (MCR), foi descrito pela primeira vez por Rodríguez-Hornedo et al., 2006. Este método é baseado na redução da solubilidade do complexo molecular que forma o cocristal, gerando condições para sua nucleação e cristalização ocorrer. A força motriz para cocristalização é a supersaturação, resultante da adição excessiva dos componentes individuais (fármaco e coformador) em solução, resultando em concentrações não estequiométricas (RODRÍGUEZ-HORNEDO et al., 2006b).

Técnicas de caracterização de cocristais

Para a confirmação da formação de um cocristal e diferenciação em relação a outros cristais multicomponentes, diversas técnicas de caracterização no estado sólido podem ser empregadas, como a difração de Raios X (HARRIS; TREMAYNE; KARIUKI, 2001), análise térmica (SCHULTHEISS; NEWMAN, 2009), microscopia (CHADWICK; DAVEY; CROSS, 2007), espectroscopia vibracional (ALLESØ et al., 2008), espectroscopia do estado sólido (VOGT et al., 2009) e análise de sorção de umidade (NEWMAN; REUTZEL-EDENS; ZOGRAFI, 2008).

A difração de raios X de pó (DRXP) é uma das ferramentas analítica mais importantes na química do estado sólido, com aplicações que vão desde a caracterização detalhada da estrutura molecular e cristalina (difração de monocristal) até a detecção de ordem de longo alcance em materiais cristalinos (difração de pó) (REUTZEL-EDENS, 2012). A DRXP permite realizar a determinação da estrutura usando dados de difração de pó. É utilizado quando o material não apresenta formato de cristais individuais de tamanho ou qualidade suficiente para o uso de difração de raios X de cristal único (HARRIS; TREMAYNE; KARIUKI, 2001). Esta análise fornece detalhes de novos grupamentos químicos encontrados nas formações dos cocristais, como as ligações de hidrogênio (BOLLA; CHERNYSHEV; NANGIA, 2017).      

A análise térmica compreende técnicas em que uma alteração física ou química é medida em função da temperatura, enquanto um material é submetido a um programa de aquecimento ou resfriamento predefinido. Entre as técnicas mais comuns utilizadas em indústrias farmacêuticas estão a calorimetria exploratória diferencial, do inglês Differential scanning calorimetry (DSC), que mede a energia necessária para estabelecer uma diferença de temperatura próxima de zero entre a amostra e uma referência inerte, e a termogravimetria (TG), uma técnica em que a variação de massa de uma substância é medida em função da temperatura ou do tempo em uma atmosfera controlada (REUTZEL-EDENS, 2012). Estes parâmetros são alterados pela formação dos cocristais e são avaliados com base na comparação entre o material cristalino obtido e os componentes individuais (SCHULTHEISS; NEWMAN, 2009).

A utilização de microscopia para avaliar a formação de cocristais é menos utilizada em comparação à técnicas espectroscópicas, que realizam análise química (REUTZEL-EDENS, 2012). Entretanto, as microscopias óptica, eletrônica e de força atômica podem apresentar informações sobre a estrutura cristalina e composição de materiais, sais e cocristais, sendo úteis para identificação da homogeneidade e caracterização dessas estruturas, de forma concomitante à outras técnicas (CHADWICK; DAVEY; CROSS, 2007; ETTER; REUTZEL, 1991).

A espectroscopia vibracional é utilizada para caracterizar as vibrações das moléculas orgânicas, por absorção de radiação infravermelha na faixa de 4000-400 cm-1 ou por espalhamento inelástico de radiação (produzindo mudanças Raman) de 3500 a 50 cm-1 (JOHNSON; RUMON, 1965). Os espectros vibracionais fornecem características das moléculas e permitem a caracterização de estruturas químicas.

Para as quantificações individuais, das concentrações do fármaco e do coformador presentes no cocristal, a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é utilizada, pois permite a separação e a quantificação de compostos químicos em solução. Já o método espectrofotométrico UV-VIS (ultravioleta visível) só é possível ser utilizado por meio da espectrofotometria derivada, que permite a análise simultânea de mais de uma substância sem procedimentos de extração (SVERSUT et al., 2017). Esse método apresenta poucos relatos na literatura, mas obteve êxito na determinação de fármacos em cocristais (SOPYAN et al., 2016), além de oferecer vantagens práticas e econômicas sobre o método CLAE e ser uma boa alternativa para o controle de qualidade (BISCAIA et al., 2020; GARCIA et al., 2006; MALESUIK et al., 2010).

Conclusão

Este capítulo abrangeu a importância dos cocristais farmacêuticos para a melhora da solubilidade de fármacos poucos solúveis. O desenvolvimento de cocristais pode ser obtido por diversos métodos, alguns são considerados fáceis, práticos e econômicos de implementar. Pode ser realizado em diversos laboratórios e não requer procedimentos caros e específicos.

Nos últimos anos, uma pluralidade de investigações tem atestado a eficácia do emprego de cocristais farmacêuticos como uma técnica de destaque no âmbito da engenharia cristalina, sinalizando a perspectiva de inúmeras pesquisas com resultados promissores em um horizonte próximo.

Referências

AAKERÖY, C. B.; SALMON, D. J. Building co-crystals with molecular sense and supramolecular sensibility. CrystEngComm, v. 7, n. 72, p. 439, 2005.

ALLESØ, M. et al. Near-infrared spectroscopy for cocrystal screening. A comparative study with Raman spectroscopy. Analytical Chemistry, v. 80, n. 20, p. 7755–7764, 2008.

ANVISA. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. NOTA TÉCNICA 02/2017 Registrode medicamentos novos, genéricos e similares contendo solvatos e cocristais como insumo farmacêutico ativo, 2017.

APSHINGEKAR, P. P. et al. Synthesis of Caffeine/Maleic Acid Co-crystal by Ultrasound-assisted Slurry Co-crystallization. Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 106, n. 1, p. 66–70, 2017.

BAGHEL, S. et al. An investigation into the crystallization tendency/kinetics of amorphous active pharmaceutical ingredients: A case study with dipyridamole and cinnarizine. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 9, n. 3, p. 1621–1637, 2009.

BATZDORF, L. et al. Make and break – Facile synthesis of cocrystals and comprehensive dissolution studies. Journal of Molecular Structure, v. 1133, p. 18–23, 2017.

BERGE, S. M.; BIGHLEY, L. D.; MONKHOUSE, D. C. Pharmaceutical Salts. Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 66, n. 1, p. 1–19, 1977.

BERRY, D. J. et al. Applying hot-stage microscopy to co-crystal screening: A study of nicotinamide with seven active pharmaceutical ingredients. Crystal Growth and Design, v. 8, n. 5, p. 1697–1712, 2008.

BERRY, D. J.; STEED, J. W. Pharmaceutical cocrystals, salts and multicomponent systems; intermolecular interactions and property based design. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 117, p. 3–24, 2017.

BISCAIA, I. F. B. et al. Development of a First-Order Derivative UV Spectrophotometric Method for the Assay and Solubility Evaluation of Lamotrigine and Nicotinamide Cocrystals. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 31, n. 12, p. 2561–2568, 2020.

BLAGDEN, N. et al. Crystal engineering of active pharmaceutical ingredients to improve solubility and dissolution rates. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 59, n. 7, p. 617–630, 2007.

BOLLA, G.; CHERNYSHEV, V.; NANGIA, A. Acemetacin cocrystal structures by powder X-ray diffraction. International Union of Crystallography, v. 4, p. 206–214, 2017.

BRITTAIN, H. G. Pharmaceutical cocrystals: The coming wave of new drug substances. Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 102, n. 2, p. 311–317, 2013.

CERREIA VIOGLIO, P.; CHIEROTTI, M. R.; GOBETTO, R. Pharmaceutical aspects of salt and cocrystal forms of APIs and characterization challenges. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 117, p. 86–110, 2017.

CHADWICK, K.; DAVEY, R.; CROSS, W. How does grinding produce co-crystals? Insights from the case of benzophenone and diphenylamine. CrystEngComm, v. 9, n. 9, p. 732–734, 2007.

CHILDS, S. L. et al. Screening strategies based on solubility and solution composition generate pharmaceutically acceptable cocrystals of carbamazepine. CrystEngComm, v. 10, n. 7, p. 856, 2008.

CHILDS, S. L.; MOUGIN, P.; STAHLY, B. C. –. Screening for Solid Forms By Ultrasound Crystallization and Cocrystallization Using Ultrasound, 2005.

CROWLEY, M. M. et al. Pharmaceutical applications of hot-melt extrusion: Part I. Drug Development and Industrial Pharmacy, v. 33, n. 9, p. 909–926, 2007.

DOUROUMIS, D.; ROSS, S. A.; NOKHODCHI, A. Advanced methodologies for cocrystal synthesis. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 117, n. 178–195, 2017.

EMA. European Medicines Agency – Reflection paper on the use of cocrystals of active substances in medicinal products. v. 44, n. May, p. 1–10, 2014.

ETTER, M. C.; ADSMOND, D. A. The Use of Cocrystallization as a Method of studying Hydrogen Bond Preferences of 2-Aminopyrimidine Margaret. Journal of the American Chemical Society, v. 589, n. 8, p. 589–591, 1990.

ETTER, M. C.; REUTZEL, S. M. Hydrogen Bond Directed Cocrystallization and Molecular Recognition Properties of Acyclic Imides. Journal of the American Chemical Society, v. 113, n. 7, p. 2586–2598, 1991.

FDA. Food and Drug Administration – Guidance for Industry Regulatory Classification of Pharmaceutical Co-Crystals. n. April, p. 1–5, 2013.

FRISCIC, T. et al. The role of solvent in mechanochemical and sonochemical cocrystal formation: a solubility-based approach for predicting cocrystallisation outcome. The Royal Society of Chemistry, v. 11, n. 3, p. 388–403, 2009.

GARCIA, C. V. et al. Development and validation of derivative spectrophotometric method for determination of rabeprazole sodium in pharmaceutical formulation. Analytical Letters, v. 39, n. 2, p. 341–348, 2006.

GOOD, D. J.; RODRÍGUEZ-HORNEDO, N. Cocrystal eutectic constants and prediction of solubility behavior. Crystal Growth and Design, v. 10, n. 3, p. 1028–1032, 2010.

GUO, M. et al. Pharmaceutical cocrystals: A review of preparations, physicochemical properties and applications. Acta Pharmaceutica Sinica B, n. xxx, 2021.

HARRIS, K. D. M.; TREMAYNE, M.; KARIUKI, B. M. Contemporary Advances in the Use of Powder X-Ray Diffraction for Structure Determination. Angewandte Chemie (International ed. in English), v. 40, n. 9, p. 1626–1651, 2001.

IZUTSU, K. et al. Characterization and Quality Control of Pharmaceutical Cocrystals. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, v. 64, n. 10, p. 1421–1430, 2016.

JOHNSON, S. L.; RUMON, K. A. Infrared Spectra of Solid 1:1 Pyridine-Benzoic Acid Complexes; the Nature of the Hydrogen Bond as a Function of the Acid-Base Levels in the Complex ¹. The Journal of Physical Chemistry, v. 69, n. 1, p. 74–86, 1965.

KAVANAGH, O. N. et al. Pharmaceutical cocrystals: from serendipity to design to application. Drug Discovery Today, v. 24, n. 3, p. 796–804, 2019.

KUMAR, A.; NANDA, A. In-silico methods of cocrystal screening: A review on tools for rational design of pharmaceutical cocrystals. Journal of Drug Delivery Science and Technology, v. 63, n. April, p. 102527, 2021.

KUMINEK, G. et al. Cocrystals to facilitate delivery of poorly soluble compounds beyond-rule-of-5. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 101, p. 143–166, 2016a.

KUMINEK, G. et al. How cocrystals of weakly basic drugs and acidic coformers might modulate solubility and stability. Chem. Commun., v. 52, n. 34, p. 5832–5835, 2016b.

MALESUIK, M. D. et al. Development of a simple, rapid and validated spectrophotometric method for nitazoxanide in pharmaceutical formulations and comparison with HPLC. Quim. Nova, v. 33, n. 9, p. 14–18, 2010.

MCNAMARA, D. P. et al. Use of a glutaric acid cocrystal to improve oral bioavailability of a low solubility API. Pharmaceutical Research, v. 23, n. 8, p. 1888–1897, 2006.

NEWMAN, A. W.; REUTZEL-EDENS, S. M.; ZOGRAFI, G. Characterization of the ‘“Hygroscopic”’ Properties of Active. Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 97, n. 3, p. 1047–1059, 2008.

OBER, C. A.; GUPTA, R. B. Formation of itraconazole-succinic acid cocrystals by gas antisolvent cocrystallization. AAPS PharmSciTech, v. 13, n. 4, p. 1396–1406, 2012.

PADRELA, L. et al. Insight into the Mechanisms of Cocrystallization of Pharmaceuticals in Supercritical Solvents. Crystal Growth and Design, v. 15, n. 7, p. 3175–3181, 2015.

QIAO, N. et al. Pharmaceutical cocrystals: An overview. International Journal of Pharmaceutics, v. 419, n. 1–2, p. 1–11, 2011.

REUTZEL-EDENS, S. M. Drug Discovery Series – Pharmaceutical Salts and Cocrystals. 16. ed. Indianapolis, USA: Royal Society of Chemistry, 2012.

ROCHA, A. B. O. et al. Cocristais: Uma Estratégia Promissora Na Área Farmacêutica. Quim. Nova, v. 39, n. 9, p. 1112–1125, 2016.

RODRÍGUEZ-HORNEDO, N. et al. Reaction crystallization of pharmaceutical molecular complexes. Molecular Pharmaceutics, v. 3, n. 3, p. 362–367, 2006.

SCHULTHEISS, N.; NEWMAN, A. Pharmaceutical cocrystals and their physicochemical properties. Crystal Growth and Design, v. 9, n. 6, p. 2950–2967, 2009.

SHAN, N.; JONES, W. A green chemistry approach to the synthesis of a crystalline organic inclusion compound. Green Chemistry, v. 5, n. 6, p. 728–730, 2003.

SHANG, N.; ZAWOROTKO, M. J. The role of cocrystals in pharmaceutical science. Trends in Pharmacological Sciences, v. 13, n. 9/10, p. 440–446, 2008.

SOPYAN, I. et al. A novel of derivative spectrophotometry as rapid and accurate method in application of simvastatin co-crystal assay. International Journal of Research in Pharmaceutical Sciences, v. 7, n. 4, p. 301–306, 2016.

STAHLY, G. P. Diversity in single- and multiple-component crystals. the search for and prevalence of polymorphs and cocrystals. Crystal Growth and Design, v. 7, n. 6, p. 1007–1026, 2007.

SVERSUT, R. A. et al. Simultaneous determination of gatifloxacin and prednisolone acetate in ophthalmic formulation using first-order UV derivative spectroscopy. Arabian Journal of Chemistry, v. 10, n. 5, p. 604–610, 2017.

TRASK, A. V. et al. Achieving polymorphic and stoichiometric diversity in cocrystal formation: Importance of solid-state grinding, powder X-ray structure determination, and seeding. Crystal Growth and Design, v. 5, n. 6, p. 2233–2241, 2005.

TRASK, A. V.; JONES, W. Crystal engineering of organic cocrystals by the solid-state grinding approach. Topics in Current Chemistry, v. 254, p. 41–70, 2005.

VEHRING, R. Pharmaceutical particle engineering via spray drying. Pharmaceutical Research, v. 25, n. 5, p. 999–1022, 2008.

VOGT, F. G. et al. Solid-State NMR Analysis of Organic Cocrystals and Complexes. Crystal Growth & Design, v. 9, n. 2, p. 921–937, 2009.

WOUTERS, J.; QUERE, L. Pharmaceutical Salts and Co-crystals. 16. ed. Cambridge, UK: RSC Drug Discovery Series, 2011.

YU, Z. Q. et al. Supersaturation Control in Cooling Polymorphic Co-Crystallization of Caffeine and Glutaric Acid. Crystal Growth & Design, v. 11, p. 4525–4532, 2011.

YU, Z. Q.; CHOW, P. S.; TAN, R. B. H. Operating regions in cooling cocrystallization of caffeine and glutaric acid in acetonitrile. Crystal Growth and Design, v. 10, n. 5, p. 2383–2387, 2010.

CAPÍTULO 6

COCRISTAIS FARMACÊUTICOS NO APRIMORAMENTO DE FÁRMACOS: UMA REVISÃO DA AVALIAÇÃO TERMODINÂMICA E CINÉTICA

PHARMACEUTICAL COCRYSTALS IN DRUG ENHANCEMENT: A REVIEW OF THERMODYNAMIC AND KINETIC EVALUATION

DOI: https://doi.org/10.56001/22.9786500466386.06

Submetido em: 17/01/2024

Revisado em: 24/01/2024

Publicado em: 25/01/2024

Isabela Fanelli Barreto Biscaia

Universidade Estadual do Centro Oeste, Departamento de Farmácia, Guarapuava-PR

http://lattes.cnpq.br/4913569775975331

Patrícia Bubna Biscaia

Universidade Estadual de Ponta Grossa, Departamento de Farmácia, Ponta Grossa-PR

http://lattes.cnpq.br/9373722894116587

Luiza Stolz Cruz

Universidade Estadual do Centro Oeste, Departamento de Farmácia, Guarapuava-PR

http://lattes.cnpq.br/1794921152056259

Camila Nogueira Pacentchuk

Universidade Estadual do Centro Oeste, Departamento de Farmácia, Guarapuava-PR

http://lattes.cnpq.br/2703438736320965

Samantha Nascimento Gomes

Universidade Estadual do Centro Oeste, Departamento de Farmácia, Guarapuava-PR

http://lattes.cnpq.br/0069997200153496

Larissa Sakis Bernardi

Universidade Estadual do Centro Oeste, Departamento de Farmácia, Guarapuava-PR

http://lattes.cnpq.br/4786154799567952

Paulo Renato de Oliveira

Universidade Estadual do Centro Oeste, Departamento de Farmácia, Guarapuava-PR

http://lattes.cnpq.br/3167101952781896

Resumo

Os cocristais farmacêuticos são formados por um ingrediente farmacêutico ativo e um coformador, uma molécula atóxica, de alta solubilidade. Eles podem ser uma solução para a indústria farmacêutica, para resolver problemas com fármacos pouco solúveis. Existem diferentes metodologias para avaliação do aumento desta solubilidade, como o método termodinâmico, no qual é determinado a solubilidade do cocristal no ponto eutético, e o método cinético, no qual é quantificado a quantidade de fármaco presente em uma solução em função do tempo. Apesar da vantagem dos cocristais em aumentar a solubilidade e dissolução de fármacos, dificilmente seria possível tirar vantagem disso em uma formulação devido à conversão rápida dos cocristais em fármaco cristalizado. Os excipientes têm um grande impacto na solubilidade dos cocristais e na estabilidade da solução. A utilização de polímeros como excipientes, pode auxiliar no desenvolvimento de formulações de formas farmacêuticas sólidas com cocristais, pois a supersaturação pode ser mantida por um tempo relevante para que ocorra a absorção.

Palavras-Chave: Cocristais Farmacêuticos, Dissolução, Polímeros, Avaliação de Cocristais.

Abstract

Pharmaceutical cocrystals are formed by an active pharmaceutical ingredient and a coformer, a non-toxic, highly soluble molecule. They can be a solution for the pharmaceutical industry to address issues with poorly soluble drugs. There are different methodologies for evaluating the increase in solubility, such as the thermodynamic method, in which the solubility of the cocrystal at the eutectic point is determined, and the kinetic method, in which the amount of drug present in a solution is quantified over time. Despite the advantage of cocrystals in enhancing the solubility and dissolution of drugs, it would be challenging to capitalize on this in a formulation due to the rapid conversion of cocrystals into crystallized drug. Excipients have a significant impact on the solubility of cocrystals and the stability of the solution. The use of polymers as excipients can assist in the development of formulations for solid pharmaceutical forms with cocrystals, as supersaturation can be maintained for a relevant time to allow absorption.

Keywords: Pharmaceutical Cocrystals, Dissolution, Polymers, Evaluation of Cocrystals

Introdução

Os cocristais, assim como os sais e dispersões sólidas amorfas, são utilizados com sucesso para melhorar as características físico-químicas e propriedades biofarmacêuticas dos fármacos a partir da formação de soluções supersaturadas (KUMINEK et al., 2016). A solução supersaturada é definida como aquela em que a concentração da solução excede a concentração da solução de equilíbrio da forma cristalina mais estável, em temperaturas e solventes específicos (SUN; WEN; TAYLOR, 2016).

Os Sistemas Supersaturados de Liberação de Fármaco (SDDS – do inglês Supersaturating Drug Delivery Systems) são capazes de aumentar a concentração do fármaco em níveis acima da solubilidade de saturação (BEVERNAGE et al., 2013). Experimentos in vitro, utilizando membranas artificiais e biológicas comprovaram que o fluxo através de uma membrana aumenta linearmente com um aumento na concentração de fármaco livre e continua a aumentar à medida que a solução se torna progressivamente mais supersaturada (PELLETT et al., 1997; RAINA et al., 2015).

Uma vez que os cocristais são compostos por um IFA e um coformador conectado por uma ligação fraca, esta ligação se dissocia em um curto período de tempo após a dissolução (FRIŠČIĆ; JONES, 2010). Quanto mais solúvel o coformador for, mais facilmente a barreira de solvatação será rompida, permitindo a retirada do coformador da rede cristalina para o meio aquoso. Assim, as moléculas de fármaco hidrofóbicas tornam-se supersaturadas no meio aquoso e por ser a forma de maior energia (metaestável), tende a precipitar (BAVISHI; BORKHATARIA, 2016).

Os polímeros têm a capacidade de inibir cineticamente a precipitação de fármacos, mantendo assim o estado de supersaturação da solução por mais tempo (ALHALAWEH; ALI; VELAGA, 2014).

Os inibidores de precipitação podem atuar para diminuir a nucleação: i) aumentando a solubilidade, reduzindo o grau de supersaturação; ii) aumentando a viscosidade, reduzindo a mobilidade molecular; iii) aumentando a energia interfacial aglomerados-solvente. Também pode atuar no crescimento do cristal: i) aumentando a viscosidade, reduzindo o coeficiente de difusão; ii) alterando a camada de adsorção na interface do meio cristalino; iii) alterando o nível de solvatação na interface cristal-líquido, afetando a integração das moléculas do fármaco no cristal (BROUWERS; BREWSTER; AUGUSTIJNS, 2009).

A avaliação adequada da supersaturação e, possivelmente da inibição da precipitação, é essencial para o desenvolvimento de formas farmacêuticas contendo cocristais e polímeros na formulação. Como a avaliação in vivo de SDDS envolve dificuldades práticas, esforços têm sido direcionados ao desenvolvimento de ensaios preditivos de precipitação in vitro.

Metodologia

Este capítulo apresenta uma abordagem de pesquisa qualitativa com características descritivas e explicativas. O levantamento bibliográfico foi conduzido por meio da busca, obtenção e análise de documentos, avaliando o conteúdo de materiais relevantes para contextualizar e embasar o tema desta pesquisa. A revisão da literatura abrangeu fontes renomadas, como Pubmed, Scielo, Mendeley e Google Acadêmico, utilizando termos-chave específicos: “Cocristais”, “Cocristais farmacêuticos”, “métodos de avaliação de cocristais” e “polímeros em associação com cocristais”.

Resultados e Discussão

• Técnicas de avaliação dos cocristais

Solubilidade

A avaliação da solubilidade dos cocristais pode ser realizada por meio de métodos cinéticos e termodinâmicos.

Os métodos cinéticos (Figura 1) determinam a dissolução de um cocristal em relação ao tempo, porém a medida que o cocristal dissolve e o máximo de concentração em solução é atingido, ocorre a cristalização do fármaco estável, então o pico de concentração não deve ser considerada a solubilidade total do cocristal (MARTIN et al., 2013). Em relação aos cocristais muito solúveis, quando submetidos à testes de dissolução, a precipitação pode ocorrer de forma imediata, resultando muitas vezes em valores subestimados ou errôneos (ROY; LIPERT; RODRÍGUEZ-HORNEDO, 2012).

O método termodinâmico avalia a solubilidade e a estabilidade dos cocristais, a partir de concentrações no ponto eutético, e é considerado mais seguro, confiável e de simples acesso (GOOD; RODRÍGUEZ-HORNEDO, 2009).

Figura 1: Representação da solubilidade por método cinético.

Fonte: Adaptado de Roy; Lipert; Rodríguez-Hornedo (2012).

Método termodinâmico

            Para avaliação do cocristal pelo método termodinâmico deve-se atingir o ponto eutético da solução. O ponto eutético (Peu) depende de fatores como temperatura, pH, solvente e presença de agentes solubilizantes, e é definido como aquele em que a solução encontra-se saturada em relação ao fármaco e ao cocristal. Esse ponto é expresso pelas concentrações de fármaco e coformador e apresenta os mesmos valores de solubilidade para o fármaco e o cocristal (GOOD; RODRÍGUEZ-HORNEDO, 2009). Portanto, comparando-se as curvas de solubilidade do fármaco e do cocristal, o Peu é caracterizado pela interseção das curvas de solubilidade (RODRÍGUEZ-HORNEDO et al., 2006).

             A constante eutética (Keu) indica a estabilidade do cocristal e é representada pela razão das atividades (a) do coformador e do fármaco no ponto eutético, as quais podem ser aproximadas à razão das concentrações (ROCHA et al., 2016). Valores de Keu> 1 ou Keu> 0,5, para cocristais 1:1 e 2:1, respectivamente, indicam instabilidade termodinâmica do cocristal, mas maior solubilidade em relação ao fármaco. Enquanto valores de Keu <1 ou <0,5 para cocristais 1:1 e 2:1, respectivamente, indicam maior estabilidade termodinâmica e menor solubilidade do cocristal em relação ao fármaco (GOOD; RODRÍGUEZ-HORNEDO, 2009).

            O ponto eutético pode ser medido experimentalmente a partir da suspensão de pequenas quantidades de fármaco e cocristal em uma solução, até que seja alcançada a saturação. As concentrações dos componentes do cocristal da fase líquida devem ser avaliadas por CLAE, e da fase sólida por DRXP e DSC para assegurar a presença de cocristal e fármaco (HUANG; RODRÍGUEZ-HORNEDO, 2010). A Figura 2 apresenta um fluxograma para auxiliar nas determinações do P_eu.

Figura 2: Esquema das etapas envolvidas na determinação das concentrações dos componentes do cocristal no P_eu.

Fonte: Adaptado de Good e Rodríguez-Hornedo (2010).

A partir da utilização do P_eu é possível determinar a solubilidade estequiométrica do cocristal pelas concentrações da solução eutética do fármaco e do coformador para um cocristal 1:1 e 2:1. As concentrações utilizadas são dadas pela soma de todas as espécies de fármaco e coformador em solução, incluindo espécies ionizadas e não ionizadas, bem como aquosas e solubilizadas (KUMINEK et al., 2016).

A solubilidade do cocristal no Peu é calculada pelas concentrações da solução eutética do fármaco e do coformador para um cocristal 1:1:

                                                      Equação 5

            A K_eu do cocristal é calculada pela razão das atividades (a) do coformador e do fármaco no ponto eutético, as quais podem ser aproximadas à razão das concentrações:

                                                       Equação 6

Método cinético

Os testes de dissolução in vitro são métodos cinéticos de avaliação do desempenho de cocristais, que correlacionam o perfil de concentração do fármaco versus o tempo. São os métodos mais encontrados na literatura, entretanto devem ser analisados com cautela devido à precipitação do fármaco (CHENEY et al., 2010; ROY; LIPERT; RODRÍGUEZ-HORNEDO, 2012).

Na indústria farmacêutica os testes de dissolução in vitro garantem o desempenho, a qualidade e a estabilidade do produto, por meio da definição de especificações para diferentes lotes de produção e condições de armazenamento. Na pesquisa os testes de dissolução in vitro são necessários para avaliar a solubilidade e o aumento da dissolução de fármacos. A dissolução in vitro permite a quantificação em tempo real das concentrações de fármacos e pode ser feito em condições sink e não-sink (SUN; WEN; TAYLOR, 2016).

A condição sink consiste em um método que resulta em uma dissolução total do fármaco, com curvas de concentração atingindo 100%. O volume do meio utilizado deve ser pelo menos três vezes o volume necessário para formar uma solução saturada do fármaco (USP, 2014). Neste método não há confirmação da capacidade da formulação em obter uma solução supersaturada do fármaco.

Os métodos de dissolução em condições não-sink utilizam um volume de meio de dissolução menor do que o necessários para dissolver todo o sólido adicionado ao experimento. Esse método proporciona a avaliação do desempenho real de SDDS, avaliando a extensão e a capacidade de atingir e manter a supersaturação de fármacos (SUN; WEN; TAYLOR, 2016). As especificações deste método não são pré-estabelecidas, deste modo, diferentes condições são consideradas não-sink, desde que estejam acima da saturação do fármaco, de acordo com a definição da Farmacopeia dos EUA (USP, 2014).

A utilização de condições não-sink em pesquisas para formulações supersaturantes é baseada em uma correlação in vitro/in vivo significativa, conforme demonstrado por estudos comparativos das dissoluções. Em um estudo com diferentes formulações de fenofibrato, a avaliação dos resultados in vivo, apresentaram similaridade com os resultados da condição não-sink e divergência com os da condição sink (VAN SPEYBROECK et al., 2010). Em um outro estudo que avaliou micropartículas de carbamazepina, os resultados farmacocinéticos in vivo também apresentaram melhores correlações com a dissolução não-sink (DONG; MAINCENT; BODMEIER, 2007).

Até o momento, o teste de dissolução é a ferramenta de avaliação in vitro mais significativa que possibilita a comparação com o desempenho in vivo dos SDDS (BAGCHI; MUKHERJEE; PLAKOGIANNIS, 2012).

• Influência de polímeros na dissolução dos cocristais

Os SDDS são capazes de aumentar a biodisponibilidade de fármacos pouco hidrossolúveis aumentando a concentração do fármaco em níveis acima da solubilidade de saturação, formando uma solução supersaturada que pode favorecer a absorção, se esta for mantida por tempo suficiente no trato gastrointestinal (BEVERNAGE et al., 2013). Tal fenômeno pode ser explicado pelo conceito mola e paraquedas (do inglês spring and parachute), ilustrado da Figura 3 (GUZMAN et al., 2007).

O cocristal gera uma solução supersaturada (representada pela linha vermelha na Figura 3) que é comparado à uma mola. Esta condição possui alta instabilidade termodinâmica quando comparada à solução saturada (condição de equilíbrio). Por esse motivo, a solução supersaturada não permanece nesse estado e tende a atingir o estado menos energético, levando a recristalização do fármaco (BORBA, 2019).

Figura 3: Dissolução de fármaco, cocristal e do cocristal + polímero. O cocristal gera uma solução supersaturada comparado à uma mola, que possui alta instabilidade termodinâmica e tende a recristalização do fármaco. A utilização de polímero inibe a precipitação e representa o “paraquedas”, que prolonga o estado supersaturado.

Fonte: Adaptado de (BAVISHI; BORKHATARIA, 2016; GUZMAN et al., 2007)).

Para que os SDDS sejam efetivos, o estado de supersaturação deve ser mantido por um tempo fisiologicamente suficiente para que possa promover a melhor absorção de fármacos pouco solúveis. Polímeros e tensoativos são geralmente aplicados nos SDDS para aumentar a estabilidade por meio da inibição da recristalização do fármaco durante a dissolução (BORBA, 2019). A utilização desses inibidores de precipitação representa o “paraquedas” da Figura 8, que prolongam o estado supersaturado por tempo suficiente para absorção (120–300 min) (BAVISHI; BORKHATARIA, 2016).

A precipitação do fármaco a partir de um SDDS ocorre por dois processos, o primeiro é a nucleação, que consiste em aglomerados/agregados de moléculas dissolvidas, que podem crescer em cristais macroscópicos atingindo o segundo processo, denominado crescimento de cristais. A etapa de nucleação requer uma energia de ativação, devido à alta tensão interfacial entre os aglomerados e o solvente. Enquanto a energia não é alcançada, nenhum novo cristal pode ser formado e uma solução supersaturada metaestável aparece. A inibição da precipitação visa estabilizar essa supersaturação, pelo maior tempo possível (BROUWERS; BREWSTER; AUGUSTIJNS, 2009).

Após a energia de nucleação ser superada, os cristais macroscópicos crescem por difusão das moléculas da solução supersaturada para a interface do cristal e pela integração da molécula na rede cristalina (KASHCHIEV; VAN ROSMALEN, 2003).

Como a supersaturação é uma condição termodinamicamente instável, ela precisa ser estabilizada por um período de tempo suficiente para absorção.

A recristalização de fármacos (ou precipitação) envolve duas etapas: nucleação e crescimento dos cristais. A primeira etapa ocorre com a aglomeração de moléculas do soluto em aglomerados bi ou tridimensionais (clusters) na solução, devido à alta tensão interfacial entre o solvente aquoso e o composto.  Assim, quando os clusters atingem tamanhos macroscópicos, segue-se para a segunda etapa, onde as moléculas se arranjam de forma periódica para formar a estrutura cristalina e consequentemente ocorre a precipitação do fármaco (ERDEMIR; LEE; MYERSON, 2009).

Os polímeros possuem a capacidade de inibir a precipitação de fármacos, mantendo por maior tempo o estado de supersaturação da solução. Eles podem atuar no processo de nucleação, por meio da formação de ligações de hidrogênio entre o polímero e o fármaco, o que aumenta a energia de ativação da nucleação, retardando e diminuindo a espontaneidade desta etapa. Também atuam no crescimento de cristais pela capacidade de serem adsorvidos na superfície cristalina, o que impede que as moléculas do soluto atinjam esta superfície (XU; DAI, 2013).

Outros mecanismos que os polímeros podem apresentar para inibir a precipitação incluem: o aumento da viscosidade, resultando numa mobilidade molecular reduzida; redução do coeficiente de difusão; e redução do grau de supersaturação pelo aumento da solubilidade da solução (BROUWERS; BREWSTER; AUGUSTIJNS, 2009)

Para o uso bem-sucedido na formação farmacêutica de comprimidos, é necessário que os cocristais sejam estabilizados pelos componentes da formulação. (ULLAH; HUSSAIN; SUN, 2015) et al., 2015, obtiveram cocristais de carbamazepina e ácido succínico pelo MCR e desenvolveram formulações utilizando três polímeros (Soluplus®, Kollidon e HPMC). Os resultados mostraram uma melhoria de 16% na taxa de dissolução in vitro no fluido intestinal simulado, e a biodisponibilidade foi significativamente melhor do que o comprimido comercial.

Em outro estudo, avaliou-se que uma formulação adequada era necessária para obter vantagem do aumento da solubilidade do cocristal 1:1 danazol: vanilina obtido por MCR. Os pesquisadores observaram que a suspensão aquosa do cocristal apresentou área sob a curva in vivo 1,7 vezes maior, enquanto a suspensão aquosa formulada contendo 1% de vitamina E-TPGS e 2% de hidroxipropilcelulose melhorou a biodisponibilidade do fármaco em mais de dez vezes (CHILDS; KANDI; LINGIREDDY, 2013).

Dai et al., 200 avaliaram a cinética da precipitação de um composto pouco solúvel em água, com potenciais aplicações no tratamento da obesidade. Os autores avaliaram a dissolução in vitro em meio biorrelevante e compararam com a absorção in vivo em estudos farmacocinéticos caninos. Os resultados mostraram que a formulação de precipitação rápida apresentou menor biodisponibilidade, enquanto as formulações de precipitação lenta e sem precipitação obtiveram uma biodisponibilidade melhor.

Também se observou vantagem na utilização de polímeros em uma pesquisa que avaliou o cocristal de lamotrigina em uma mistura em pó com polímero, em meio biorrelevante FaSSIF, detectando-se um aumento de até 3,7 vezes na dissolução do fármaco com o polímero HPMC E6 na proporção 1:0,1 (m/m cocristal:polímero) (BISCAIA et al., 2022).

Conclusão

Neste capítulo, foram abordados os métodos de avaliação de cocristais farmacêuticos, buscando verificar de maneira conclusiva se houve, de fato, aprimoramento na solubilidade de fármacos pouco solúveis mediante o seu desenvolvimento. A diversidade de metodologias utilizadas para a avaliação de cocristais é notável, revelando uma falta de padronização nesse contexto, o que por sua vez cria uma lacuna na comparação dos resultados obtidos por distintos pesquisadores.

Destaca-se, no entanto, que a associação de cocristais com polímeros demonstrou ser altamente vantajosa, conforme evidenciado por diversos estudos científicos. Essa abordagem representa uma perspectiva promissora para otimizar a solubilidade de fármacos, oferecendo contribuições valiosas para o desenvolvimento futuro de formulações farmacêuticas mais eficazes e estáveis.

Referências

ALHALAWEH, A.; ALI, H. R. H.; VELAGA, S. P. Effects of polymer and surfactant on the dissolution and transformation profiles of cocrystals in aqueous media. Crystal Growth and Design, v. 14, n. 2, p. 643–648, 2014.

BAGCHI, S.; MUKHERJEE, T.; PLAKOGIANNIS, F. Re-evaluation of in vitro dissolution techniques for supersaturating drug delivery systems. Pharmaceutical Development and Technology, v. 17, n. 4, p. 477–482, 2012.

BAVISHI, D. D.; BORKHATARIA, C. H. Spring and parachute: How cocrystals enhance solubility. Progress in Crystal Growth and Characterization of Materials, v. 62, n. 3, p. 1–8, 2016.

BEVERNAGE, J. et al. Evaluation of gastrointestinal drug supersaturation and precipitation: Strategies and issues. International Journal of Pharmaceutics, v. 453, n. 1, p. 25–35, 2013.

BISCAIA, I. F. B. et al. Effects of Polymers on the Supersaturation Studies of Lamotrigine – Nicotinamide Cocrystals in Water and Biorelevant Medium. Journal of Drug Delivery Science and Technology, v. 73, n. 103451, 2022.

BORBA, A. A. Desenvolvimento e investigação de sistemas supersaturados de liberação do fármaco telmirsatana. [s.l: s.n.].

BROUWERS, J.; BREWSTER, M. E.; AUGUSTIJNS, P. Supersaturating Drug Delivery Systems: The Answer to Solubility-Limited Oral Bioavailability? Journal of pharmaceutical sciences, v. 98, n. 8, p. 2049–2072, 2009.

CHENEY, M. L. et al. Effects of crystal form on solubility and pharmacokinetics: A crystal engineering case study of lamotrigine. Crystal Growth and Design, v. 10, n. 1, p. 394–405, 2010.

CHILDS, S. L.; KANDI, P.; LINGIREDDY, S. R. Formulation of a Danazol Cocrystal with Controlled Supersaturation Plays an Essential Role in Improving Bioavailability. Molecular Pharmaceutics, v. 10, n. 8, p. 3112–3127, 2013.

DAI, W. et al. Evaluation of Drug Precipitation of Solubility-Enhancing Liquid Formulations Using Milligram Quantities of a New Molecular Entity ( NME ). Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 96, n. 11, p. 2957–2969, 2007.

DONG, W. Y.; MAINCENT, P.; BODMEIER, R. In vitro and in vivo evaluation of carbamazepine-loaded enteric microparticles. International Journal of Pharmaceutics, v. 331, n. 1, p. 84–92, 2007.

ERDEMIR, D.; LEE, A. Y.; MYERSON, A. S. Nucleation of crystals from solution: Classical and two-step models. Accounts of Chemical Research, v. 42, n. 5, p. 621–629, 2009.

FRIŠČIĆ, T.; JONES, W. Benefits of cocrystallisation in pharmaceutical materials science: An update. Journal of Pharmacy and Pharmacology, v. 62, n. 11, p. 1547–1559, 2010.

GOOD, D. J.; RODRÍGUEZ-HORNEDO, N. Solubility Advantage of Pharmaceutical Cocrystals. Crystal Growth & Design, v. 9, n. 5, p. 2255–2264, 2009.

GUZMAN, H. R. et al. Combined Use of Crystalline Salt Forms and Precipitation Inhibitors to Improve Oral Absorption of Celecoxib from Solid Oral Formulations. Journal of pharmaceutical sciences, v. 96, n. 10, p. 2686–2702, 2007.

HUANG, N.; RODRÍGUEZ-HORNEDO, N. Effect of micellar solubilization on cocrystal solubility and stability. Crystal Growth and Design, v. 10, n. 5, p. 2050–2053, 2010.

KASHCHIEV, D.; VAN ROSMALEN, G. M. Review: Nucleation in solutions revisited. Crystal Research and Technology, v. 38, n. 7–8, p. 555–574, 2003.

KUMINEK, G. et al. Cocrystals to facilitate delivery of poorly soluble compounds beyond-rule-of-5. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 101, p. 143–166, 2016.

MARTIN, F. A. et al. Ketoconazole salt and co-crystals with enhanced aqueous solubility. Crystal Growth and Design, v. 13, n. 10, p. 4295–4304, 2013.

PELLETT, M. A. et al. The penetration of supersaturated solutions of piroxicam across silicone membranes and human skin in vitro. Journal of Controlled Release, v. 46, n. 3, p. 205–214, 1997.

RAINA, S. A. et al. Impact of Solubilizing Additives on Supersaturation and Membrane Transport of Drugs. Pharmaceutical Research, v. 32, n. 10, p. 3350–3364, 2015.

ROCHA, A. B. O. et al. Cocristais: Uma Estratégia Promissora Na Área Farmacêutica. Quim. Nova, v. 39, n. 9, p. 1112–1125, 2016.

RODRÍGUEZ-HORNEDO, N. et al. Reaction crystallization of pharmaceutical molecular complexes. Molecular Pharmaceutics, v. 3, n. 3, p. 362–367, 2006.

ROY, L.; LIPERT, M. P.; RODRÍGUEZ-HORNEDO, N. Co-crystal Solubility and Thermodynamic Stability. Pharmaceutical salts and co-crystals, p. 247–279, 2012.

SUN, D. D.; WEN, H.; TAYLOR, L. S. Non-Sink Dissolution Conditions for Predicting Product Quality and In Vivo Performance of Supersaturating Drug Delivery Systems. Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 105, n. 9, p. 2477–2488, 2016.

ULLAH, M.; HUSSAIN, I.; SUN, C. C. The development of carbamazepine-succinic acid cocrystal tablet formulations with improved in vitro and in vivo performance formulations with improved in vitro and in vivo performance. Drug Development and Industrial Pharmacy, v. 9045, n. October, 2015.

USP. United States Pharmacopeia. The Dissolution Procedure: Development and Validation, USP 36, n. 735, 2014.

VAN SPEYBROECK, M. et al. Enhanced absorption of the poorly soluble drug fenofibrate by tuning its release rate from ordered mesoporous silica. European Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 41, n. 5, p. 623–630, 2010.

CAPÍTULO 7

PROCEDIMENTOS QUE RETARDAM O ENVELHECIMENTO CUTÂNEO E MODELOS EXPERIMENTAIS PARA ANÁLISE DE ATIVIDADE ANTIENVELHECIMENTO

PROCEDURES THAT DELAY SKIN AGING AND EXPERIMENTAL MODELS FOR ANALYSIS OF ANTI-AGING ACTIVITY

DOI: https://doi.org/10.56001/22.9786500466386.07

Submetido em: 15/01/2024

Revisado em: 22/01/2024

Publicado em: 25/01/2024

Natan Cordeiro da Silva

Universidade Federal de Pernambuco – Programa de Pós-Graduação em Morfotecnologia, Centro de Biociências, Departamento de Histologia e Embriologia – Recife, Pernambuco, Brasil.

http://lattes.cnpq.br/5861102020265570

Bruno José da Silva Bezerra

Universidade Federal de Pernambuco – Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Centro de Biociências, Departamento de Bioquímica – Recife, Pernambuco, Brasil.

http://lattes.cnpq.br/5524038913919195

Eliandra de Andrade Santos

Faculdade Santíssima Trindade – Nazaré da Mata, Pernambuco, Brasil.

http://lattes.cnpq.br/8406652015335811

Alyce Gabrielle de Araújo Oliveira

Faculdade Santíssima Trindade – Nazaré da Mata, Pernambuco, Brasil.

http://lattes.cnpq.br/3672804570727587

Aureliany da Conceição Patricio

Faculdade Santíssima Trindade – Nazaré da Mata, Pernambuco, Brasil.

https://lattes.cnpq.br/4961901146283930

José Manoel do Nascimento

Faculdade Santíssima Trindade – Nazaré da Mata, Pernambuco, Brasil.

http://lattes.cnpq.br/4868187494735855

Luciana Ângelo Bezerra

Faculdade Santíssima Trindade – Nazaré da Mata, Pernambuco, Brasil.

http://lattes.cnpq.br/1514594071254110

Noemia Pereira da Silva Santos

Universidade Federal de Pernambuco – Programa de Pós-Graduação em Morfotecnologia, Centro de Biociências, Departamento de Histologia e Embriologia – Recife, Pernambuco, Brasil.

http://lattes.cnpq.br/1521392734944183

Maria Tereza dos Santos Correia

Universidade Federal de Pernambuco – Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Centro de Biociências, Departamento de Bioquímica – Recife, Pernambuco, Brasil.

http://lattes.cnpq.br/7863845087003953

Fernanda Miguel de Andrade

Universidade Federal de Pernambuco – Programa de Pós-Graduação em Morfotecnologia, Centro de Biociências, Departamento de Histologia e Embriologia – Recife, Pernambuco, Brasil.

http://lattes.cnpq.br/8915203118340030

Resumo

Apesar de fisiológico, as consequências do envelhecimento da pele são indesejadas por boa parte da população. Principalmente se esse processo for acelerado por fatores externos como a poluição e os raios solares, levando os sinais característicos do envelhecimento a aparecerem precocemente. O prelúdio de rugas, flacidez e manchas na pele leva cada vez mais pessoas a procurarem profissionais capazes de tratar esses problemas e revertê-los. O objetivo deste trabalho é descrever os procedimentos utilizados atualmente para retardar o envelhecimento da pele e explicar os modelos experimentais disponíveis para a análise de atividade antienvelhecimento. Existem diversos métodos utilizados para retardar o envelhecimento da pele ou revertê-lo, boa parte deles estão voltados para induzir a produção de colágeno, como o microagulhamento e os bioestimuladores de colágeno. Existem alguns problemas relacionados a utilização dos produtos atuais, como reações adversas graves, procedimentos invasivos e baixa durabilidade. Por isso, existe a necessidade da busca de novos compostos estimulantes da produção de colágeno, assim como a análise dos métodos experimentais utilizados para a análise de atividade antienvelhecimento. Entre os métodos experimentais utilizados para esse tipo de análise, existem os testes em animais, que vem cada vez menos sendo utilizados e os in vitro, com a utilização de células, que hoje, são mais indicados por questões éticas e terem boa comparabilidade com o organismo humano.

Palavras-chave: Envelhecimento da pele. Colágeno. Matriz Extracelular.

Abstract: Despite being physiological, the consequences of skin aging are unwanted by a large part of the population. Especially if this process is accelerated by external factors such as pollution and sunlight, causing the characteristic signs of aging to appear prematurely. The prelude to wrinkles, sagging and blemishes on the skin leads more and more people to look for professionals capable of treating these problems and reversing them. The objective of this work is to describe the procedures currently used to delay skin aging and explain the experimental models available for the analysis of anti-aging activity. There are several methods used to stop skin aging or reverse it, most of them are aimed at inducing collagen production, such as microneedling and collagen bio-stimulators. There are some problems related to the use of current products, such as serious adverse reactions, invasive procedures and low durability. Therefore, there is a need to search for new compounds that stimulate collagen production, as well as the analysis of experimental methods used to analyze anti-aging activity. Among the experimental methods used for this type of analysis, there are animal tests, which are being used less and less, and in vitro tests, using cells, which today are more recommended for ethical reasons and have good comparability with the organism. human.

Keywords: Skin aging. Collagen. Extracellular Matrix.

Introdução

O envelhecimento da pele é um processo fisiológico que acomete todos os indivíduos humanos no decorrer da vida. Estima-se que aproximadamente aos vinte e cinco anos de idade inicia-se o declínio das atividades biológicas da pele e consequentemente o início do desgaste natural. Ignorando os fatores externos que induzem esse processo, a pele levaria anos para apresentar marcas de expressões características do envelhecimento, pois esse processo é lento (Csekes; Racková, 2021).

            O problema, é que existem diversos agentes externos que aceleram a degradação desse tecido, como o tabaco, má alimentação, raios solares e até mesmo a poluição. Quanto maior o nível de exposição, mais rápido torna-se a deterioração de substâncias importantes para a pele e inicia-se o aparecimento precoce das rugas e flacidez (Cui et al., 2021).

            A pele é subdividida em epiderme e derme, sendo a derme a parte mais profunda desse tecido. Nela está presente a matriz extracelular (MEC), composta por fibras colágenas e elásticas, ácido hialurônico (AH) e outros componentes. A MEC possui várias funcionalidades e entre elas, é responsável pelo preenchimento da pele, pela elasticidade e sustentação do tecido (Nguyen; Soulika, 2019; Shin et al., 2019).

Com o envelhecimento, temos uma degradação desordenada dos componentes da MEC sem substituição. Os fatores extrínsecos que levam a essa degradação, basicamente induzem a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e esses compostos provocam diversas cascatas de reações que degradam substâncias. Um exemplo é que as EROs induzem a produção de enzimas metaloproteinases (MMPs), que degradam as fibras de colágeno, além disso, também inibem diretamente a síntese de colágeno pelos fibroblastos (Ho; Dreesen, 2021).

            Existem diversos métodos utilizados para tentar retardar o envelhecimento da pele. A maioria voltado para a renovação das fibras de colágeno, onde os mais eficazes tendem a ter baixa durabilidade, serem invasivos e em alguns casos apresentam efeitos colaterais graves. Por esse motivo, diversos estudos buscam métodos alternativos e novas substâncias que possam ser mais eficazes e seguras para retardarem o envelhecimento da pele (Csekes; Racková, 2021).

Com base no descrito, o objetivo deste trabalho é descrever os procedimentos utilizados atualmente para retardar o envelhecimento da pele e explicar os modelos experimentais disponíveis para a análise de atividade antienvelhecimento.

Revisão Bibliográfica

• Estratégias para retardar o envelhecimento da pele

Com o aumento da valorização da aparência pela sociedade como um todo, tem-se buscado cada vez mais procedimentos e substâncias que retardem o envelhecimento da pele. A utilização de processos mecânicos, como o microagulhamento, e de bioestimuladores de colágeno, como a hidroxiapatita de cálcio, são exemplos de procedimentos que induzem a produção de colágeno e logo retardam ou revertem a flacidez da pele (Zouboulis et al., 2019).

A busca por produtos antienvelhecimento da pele tende a focar principalmente no colágeno. Vendo que após o início do envelhecimento existe um ciclo de destruição das fibras de colágeno de forma mais acentuada, onde a degradação se torna maior que a reposição. (Dayan et al., 2019). Uma das possibilidades é a busca de agentes que inibam as enzimas degradadoras de colágeno, as (MMPs) MMP-1, MMP-8 e MMP-13 (colagenases). Essa inibição faria com que essas enzimas ficassem impedidas de degradar as fibras de colágeno existentes, logo a pele permaneceria com os espaços da MEC bem preenchidos. Porém, esse mecanismo não levaria em consideração a renovação dos componentes da MEC, e se os fibroblastos pararem ou reduzirem a liberação de colágeno, com o passar do tempo a pele continuará envelhecendo por falta de renovação (Shin et al., 2019).

Outra opção, seria inibir a produção EROs ou degradá-las, como a vitamina C atua. Com isso, existiria uma redução da formação de MMPs e logo uma menor degradação das fibras de colágeno. Porém, inibir a produção das EROs se torna algo muito improvável, levando em consideração que vários mecanismos celulares liberam essas espécies e que ações extrínsecas ao corpo promovem a formação dessas espécies, como os hábitos alimentares e a própria exposição aos raios solares, por exemplo (Boo, 2022).

Atualmente, sabe-se que um fator muito importante para a estimulação da produção de colágeno pelos fibroblastos é a indução da inflamação da região. Essa indução controlada faz com que os fibroblastos voltem a sua atividade normal e comecem a sintetizar colágeno (Taub; Pham, 2018). Fica claro que entre as possibilidades de mecanismos, a indução da reativação da produção do colágeno pelos fibroblastos seria a ideal. Essa indução faz com que os espaços intercelulares sejam novamente preenchidos e que a ligação entre os fibroblastos e a MEC seja retomada (Shin et al., 2019).

• Retinóides

Os retinóides, são a vitamina A e seus derivados, normalmente utilizados para o tratamento da acne, manchas e rugas. De forma geral, para o tratamento de rugas esses medicamentos atuam através de receptores do ácido retinóico (RARs) e receptores X (RXRs) e acabam aumentando a quantidade de procolágeno e consequentemente colágeno do tipo I, III e VII, além de estimular a produção, eles também contribuem para a organização das fibras colágenas (Shin et al, 2019).

A principal utilização dessas substâncias é para o tratamento de acne. A isotretinoína, o medicamento mais famoso dessa classe é utilizado com muita frequência para a redução da oleosidade da pele e consequentemente o fim das acnes. Possui uma grande efetividade e atua basicamente provocando uma descamação da camada córnea, afinando a pele e atrofiando as glândulas sebáceas, impedindo a produção de oleosidade (Fallah; Rademaker, 2021).

Apesar da sua eficácia, esses produtos apresentam efeitos colaterais bem incômodos. A isotretinoína, por exemplo, por ser utilizada de forma sistêmica provoca um ressecamento em toda a pele, os lábios ressecam, aparecem rachaduras e podem apresentar sangramento. A pele fica sensível ao sol, podendo os usuários apresentarem irritações e existem várias evidências de casos de depressão relacionados ao uso (Huang; Cheng, 2017).

Já um dos efeitos colaterais mais graves acontece em mulheres que fazem uso desses produtos na gestação, pois podem provocar abortos espontâneos além de teratogenias graves aos bebês. Por esse motivo, retinóides de uso sistêmico fazem parte das substâncias de controle especial e existe todo um protocolo estabelecido por lei para que se autorize a utilização dessas substâncias (Alvarenga, 2015).

• Ácido Hialurônico

Outra estratégia antienvelhecimento bastante utilizada é o preenchimento, que consiste em utilizar um produto, por exemplo o (AH) para preencher os espaços da MEC, o que leva a uma interação melhorada entre os fibroblastos e a MEC. Além disso, o AH induz a produção de colágeno pelos fibroblastos através da via de sinalização TGF-ÿ (Scarano et al, 2021).

O AH é um glicosaminoglicano, polissacarídeos de preenchimento da MEC de vários tecidos, que também está presente na derme, sofre redução com aumento da idade e sua ausência também contribui para o aparecimento de rugas. Essa molécula consegue reter uma grande quantidade de água, mantém a região preenchida e a pele bem hidratada (Figura 1). O preenchimento com o gel de AH na pele se dá de forma invasiva por administração com agulhas diretamente na derme (Cui et al., 2021).

Figura 1 – Efeito de preenchimento do ácido hialurônico.

Fonte: Autoria própria (2023).

Existem alguns cosméticos que utilizam outras formas de administração, como na forma de sal, o hialuronato de sódio. Quando o sal tem baixo peso molecular como no caso do Oligo AH ele consegue penetrar com maior facilidade e chegar à derme. Já quando tem um peso molecular elevado só penetra a primeira camada da pele, absorve grande quantidade de água e dá um preenchimento temporário de algumas horas. Um exemplo de utilização desse tipo de AH é a utilização em gloss ou batons que dão um inchaço temporário aos lábios (Wohlrab; Hilpert; Wolff, 2016; Dayan et al, 2019).

• Hidroxiapatita de cálcio

Os bioestimuladores de colágeno são também produtos utilizados com a finalidade antienvelhecimento que tem uma ótima aceitação comercial. Entre esses produtos, destaca-se a hidroxiapatita de cálcio como um dos mais utilizados. Consiste em uma molécula sintética biocompatível composta por fosfato de cálcio cristalino, são pequenas esferas que possuem a capacidade de serem biodegradáveis com o tempo (Csekes; Racková, 2021).

            Logo após a administração, ele provoca um preenchimento imediato e momentâneo da região da aplicação, removendo assim as rugas. Devido a uma reação inflamatória provocada de forma controlada, os fibroblastos se dirigem a região da aplicação e são estimulados a produzir colágeno tipo I e III. Com o passar do tempo essas esferas começam a ser degradadas e fagocitadas lentamente e ao mesmo tempo o colágeno tipo I vai sendo produzido e substituindo o espaço dessas esferas no tecido (Figura 2). Esse processo é lento, inicia-se dentro de um mês e pode durar até um ano, já os efeitos da aplicação, podem ter uma durabilidade de três anos (Wohlrab; Hilpert; Wolff, 2016).

Figura 2 – Efeito da administração de hidroxiapatita de cálcio na pele. 

Fonte: Autoria própria (2023).

Esses bioestimuladores são normalmente seguros, e raramente apresentam efeitos adversos graves. No caso da hidroxiapatita de cálcio são comuns edemas e pequenas manchas pós aplicação, mas que desaparecem em alguns dias. Pode acontecer a formação de granulomas na região da aplicação devido à má aplicação e eles podem ser revertidos com massagem (Dayan et al., 2019).

• Ácido ascórbico

Uma substância que tem um papel essencial na síntese do colágeno é o ácido ascórbico (Vitamina C), uma molécula natural importante na promoção da bioestimulação do colágeno pelos fibroblastos. Ele é um excelente antioxidante, impede a oxidação de duas enzimas percursoras do colágeno, a prolil e a lisil hidroxilase, duas enzimas férricas que oxidam facilmente na ausência da vitamina C. Além de contribuir com essa síntese, contribui também na desativação de EROs, provocando a sua redução e logo uma redução na formação das MMPs (Gref et al., 2020).

 Existem vários cosméticos a base de vitamina C no mercado que tem como foco especial a pele. Como a biodisponibilidade do ácido ascórbico na pele não é efetiva quando ele é administrado por via oral, os produtos voltados para essa finalidade são normalmente tópicos. Um problema enfrentado para essa administração é a permeabilidade da Vitamina C à camada córnea, devido a sua baixa lipofilicidade, o que faz com que esse composto tenha que ser conjugado com agentes lipofílicos para facilitar a passagem por essa barreira (Boo, 2022).

Além da dificuldade de permeabilidade, a vitamina C apresenta uma instabilidade em condições normais de temperatura e ambiente. Existe todo um cuidado e cautela com os produtos cosméticos a base desse produto e ainda assim, muitos podem perder a qualidade devido às más condições de armazenamento (Dayan et al., 2019).

• Microagulhamento

            O microagulhamento ou indução percutânea de colágeno é uma técnica simples que busca provocar pequenos furos (lesões) com várias agulhas para estimular a inflamação e consequentemente a produção de colágeno e elastina pelos fibroblastos de forma natural (Figura 3). É uma técnica minimamente invasiva que apresenta ótimos resultados, provoca a redução das rugas, da flacidez da pele, estrias e até de melasma.  Essa técnica pode ser associada ao uso de alguns cosméticos após as microperfurações, como por exemplo a vitamina C para potencializar o estímulo (Albano; Pereira; Assis, 2018).

    Figura 3 – Microagulhamento e estímulo da produção de colágeno.

Fonte: Autoria própria (2023).

            O estímulo de produção ocorre por essas micro-lesões provocarem a liberação de citocinas, fatores de crescimento e neutrófilos, que por sua vez sinalizam e estimulam os fibroblastos a migrarem e iniciarem a produção das fibras elásticas e de colágeno na região lesionada. No início a produção de colágeno é principalmente do tipo III e em menor quantidade tipo I, essa conformação dura alguns meses até um processo de remodelação do tecido, onde o colágeno tipo III é convertido no tipo I e esse permanece por vários anos (Albano; Pereira; Assis, 2018).

• Colágeno

Além de vários produtos voltados para o estímulo da produção de colágeno, existe ainda também o próprio colágeno, que é comercializado em diversas formas. Entre esses produtos, alguns se apresentam como moléculas de colágeno inteiras e outras como moléculas de colágeno fragmentadas, ditos peptídeos de colágeno. Para isso, é realizado uma reação de hidrólise da molécula para que aconteça a quebra dos peptídeos, resultando no famoso colágeno hidrolisado. As diferentes formas de apresentação modificam apenas o tempo de absorção, onde o colágeno hidrolisado será absorvido mais rapidamente (Porfírio; Fanaro, 2016). 

O colágeno administrado por via oral é considerado um nutracêutico seguro, sua suplementação principalmente para idosos é muito bem recomendada, pois contribui para uma revitalização da pele, o fortalecimento das cartilagens e prevenção da osteoporose ou da sua progressão, doença essa que atinge principalmente a população idosa (Zouboulis et al., 2019).

Uma das desvantagens da administração oral do colágeno é que a sua molécula não é absorvida inteira, antes que aconteça a absorção, quando não hidrolisado, ela precisa ser hidrolisada e esse processo ocorre quase que por completo no duodeno e no jejuno pelo suco pancreático, viram pequenos peptídeos ou aminoácidos. Depois de absorvidos essas substâncias são distribuídas para diversas reações, uma quantidade infinitesimal pode ser direcionada para a formação de colágeno, o restante se perde em outras reações ou são excretadas (Porfirio; Fanaro, 2016).

• Modelos experimentais que buscam analisar atividades antienvelhecimento

Na ciência, existem diversos métodos experimentais para a realização de testes sobre eficácia de fármacos. Sabe-se que nada substitui os testes realizados diretamente no ser humano, porém para esses testes são levantadas diversas questões éticas devido à possibilidade de que substâncias desconhecidas podem levar ao surgimento de sequelas graves e até a morte (Williams, 2006). Por isso, antes das testagens em humanos, são buscadas possibilidades de estudos em outras formas e modelos semelhantes, que possam trazer resultados fidedignos e representem teoricamente o que aconteceria no homem. Só depois de vários estudos que comprovem a eficácia e a sua segurança é que esses protótipos podem ser testados nos seres humanos (Moon et al., 2021). 

Dentre esses métodos utilizados que possam ser confiáveis existem a utilização de animais como cobaias para testes de toxicidade e eficácia, esse é um dos métodos mais utilizados, mas vem perdendo espaço gradativamente por também envolver vidas (Monteiro et al., 2013). O avanço da ciência tem permitido que a utilização dos animais em pesquisas científicas possa ser reduzida. Com a pressão da sociedade e os avanços tecnológicos várias indústrias têm buscado métodos alternativos espontaneamente para a realização de experimentos, com a finalidade de abolir a utilização de animais. Recentemente, o Senado Brasileiro aprovou o projeto de lei PLC 70/2014 que proíbe a utilização de animais em pesquisas e testes para a produção de cosméticos, produtos de higiene pessoal e perfumes; a lei entrou em vigor em 24 de fevereiro de 2023 através da resolução n°58, esse marco torna-se um grande avanço para o fim dos testes em animais no Brasil (Disner, 2019; Diario Oficial Da União, 2023).

Estudos in vitro representam o funcionamento celular e os processos bioquímicos, sendo capazes de apresentarem boa comparabilidade com os estudos com o corpo humano. Ademais, não trazem prejuízos para vidas, sendo assim um método eficaz e seguro para a realização de estudos tanto para atividade de protótipos quanto de toxicidade. Dentro da área de cultura celular, existem possibilidades de estudos como (Disner, 2019):

• Monoculturas: culturas celulares que utilizam apenas um tipo celular no meio, como por exemplo, apenas fibroblastos;
• Co-culturas: culturas celulares que utilizam mais de um tipo celular no meio como por exemplo, a utilização de fibroblastos, queratinócitos e melanócitos;
• Culturas 2D: culturas celulares que ficam em superfície plana, as células interagem apenas lado a lado e se multiplicam uma ao lado das outras de forma horizontal;
• Culturas 3D: modelo que possibilita uma maior representatividade do modelo fisiológico original, possibilita que as células interajam com o ambiente em todas as direções. Permite uma maior interação célula-célula.

Então, principalmente para estudos preliminares, modelos in vitro devem ser os métodos adotados em estudos de descoberta de novos fármacos. Ficando os estudos com seres humanos para etapas finais do desenvolvimento (Williams, 2006).

A utilização de modelos in vitro é uma alternativa ideal para realização de experimentos preliminares levando em consideração a confiabilidade desse modelo, a humanização do processo e a possibilidade de repetições simultâneas dos testes (Suzuki et al., 2020). Esses modelos utilizam células de animais que reproduzem os processos fisiológicos e com isso, possibilita a visualização das respostas celulares a possíveis fármacos. Os testes com culturas celulares não substituem totalmente os testes com o ser humano, pois trata-se de um organismo complexo, que possibilita muitas variáveis. Porém além de respostas semelhantes, pode-se destacar também como vantagem a reprodutibilidade, a rapidez em que os testes podem ser realizados e a necessidade de uma quantidade de amostras reduzida (Moon et al., 2021).

• Lectina de Cratylia mollis

            As lectinas são proteínas bioativas de origem não imunológica com capacidades moduladoras para diversos mecanismos fisiológicos. Elas se ligam reversivelmente a carboidratos e por isso desempenham papeis importantes em mecanismos celulares, como capacidades mitogênicas e indutores de síntese de proteínas. Podem ser encontradas em diversas formas de vidas, como plantas, animais e microrganismos (Gautam et al., 2020).

A primeira lectina identificada foi a ricina, extraída da Ricinus communis L. (mamona) em 1888 por Stillmark, quando ele observou a atividade hemoaglutinante do extrato. Apesar de ter sido descoberta a muito tempo, a pouco menos de um século é que se começou a estudar de forma mais difundida as lectinas existentes e as suas atividades.  Existem diversas lectinas conhecidas que são extraídas principalmente de plantas leguminosas, entre elas a que está mais bem caracterizada até o momento é a Concanavalina A (Con A) que é uma lectina extraída da planta Canavalia ensiformis (Huldani et al., 2022).

            Por serem seletivas a carboidratos, apresentam capacidade de se ligar especificamente e reversivelmente a carboidratos da parede celular de eritrócitos em sistemas sanguíneos ABO e MN, através de ligações hidrofóbicas e de hidrogênio. Essa propriedade permite as lectinas a capacidade de aglutinar os eritrócitos de forma seletiva e isso distingue as mesmas de outras moléculas como as glicotransferases. Através dessa ligação às proteínas da parede celular dos eritrócitos é possível a realização do teste de hemoaglutinação para verificar a presença e/ou atividade de lectinas (Figura 4) (Sá et al., 2009).

Figura 4 – Hemoaglutinação mediada por uma lectina.

Fonte: Autoria própria (2023).

Elas podem ser encontradas naturalmente ligadas reversivelmente a proteínas de paredes celulares, pois muitas dessas proteínas são glicolisadas e se tornam um sítio de ligação para essas lectinas através do seu ‘‘sítio de ligação a carboidrato’’ (Domínio de Reconhecimento a Carboidrato – CDR) um mecanismo conhecido como encaixe induzido (Nascimento et al., 2020).

A Cramoll 1,4 é uma lectina muito semelhante a Con A e possui diversos efeitos fisiológicos já conhecidos. Essa lectina é extraída das sementes de Cratylia mollis (feijão camaratu), uma leguminosa nativa do nordeste brasileiro, predominante do bioma Caatinga, que se apresenta em formas de arbustos. Quando a extração é realizada, é obtido diversas formas moleculares da lectina: Cramoll 1, Cramoll 2, Cramoll 3 e Cramoll 4. A Cramol 1,4 é uma associação das duas formas moleculares específica para glicose/manose (Melo et al., 2011).

Dentre as atividades observadas até o momento da Cramoll 1,4 pode-se destacar as atividades imunomoduladoras e anti-infecciosas (Carneiro et al., 2021), pró-inflamatórias e mitogênicas (Melo et al., 2010), antitumoral (Cunha et al., 2016), e cicatrizante (Melo et al., 2011; Pereira et al., 2012; Andrade et al., 2021). Podendo ela mediar processos infecciosos contra agentes invasores, contribuindo com ativações de citocinas importantes para estimulação de células do sistema imune, como as interleucinas e fatores de crescimento (Oliveira et al., 2013).

Recentemente Andrade e colaboradores (2021) ao analisar a atividade cicatrizante da Cramoll 1,4 em camundongos diabéticos, conseguiram observar que ao final do experimento de 12 dias além da Cramoll ter acelerado a reepitelização, ocorreu também um maior depósito de colágeno tipo I nas feridas do grupo em que foi utilizado essa lectina, mostrando que ela atua acelerando a cicatrização mesmo em situações adversas.

Levando em consideração que a Cramoll apresenta atividade pró-inflamatória e atua acelerando a deposição de colágeno tipo I no processo cicatricial, e sendo esse o principal tipo de colágeno na pele humana, o que melhor se organiza e preenche de forma moduladora a pele, essa lectina pode se tornar uma excelente candidata a um produto cosmético antienvelhecimento.

• Galactomananas

Os polissacarídeos são carboidratos formados por grandes polímeros de monossacarídeos ligados covalentemente uns aos outros. Esses compostos extraídos de fontes naturais têm ganhado cada vez mais destaque em várias indústrias por apresentar diversas vantagens como sua biocompatibilidade, baixo custo e fácil obtenção (Silva et al., 2020).

As galactomananas são polissacarídeos extraídos do endosperma de sementes de plantas, principalmente leguminosas com diversas aplicabilidades em vários setores, como na indústria farmacêutica, cosmética e alimentícia. Por terem alto peso molecular, serem solúveis em água e não iônicas possuem as características ideais para a formação de sistemas altamente viscosos e em baixas concentrações. Assim, podem ser utilizados para a preparação de filmes cosméticos, estabilizadores de emulsão e para a formação de hidrogéis (Albuquerque et al., 2017).

É importante destacar também a capacidade de imobilização de biomoléculas. No estudo de Albuquerque e colaboradores (2016) foi realizado imobilização da Cramoll 1,4 no hidrogel de Galactomanana extraído de Cassia grandis, uma árvore nativa brasileira. Além de ter permitido uma liberação controlada Cramoll 1,4, o hidrogel permitiu estabilidade que manteve as características naturais até 30 dias e sem contaminações microbiológicas.

Uma vantagem da utilização do hidrogel de Galactomanana como imobilizador da Cramol para os fins cosméticos é a sua intimidade com o estrato córneo da pele. Já que a Cramol necessita ultrapassar o estrato para induzir a produção de colágeno dérmico, estar associado a um hidrogel que facilite esse transporte pode ser fundamental para que aconteça de forma definitiva esse processo (Albuquerque et al., 2016).

Considerações Finais

            Existem diversos procedimentos e substâncias que são utilizadas para retardar ou reverter o processo do envelhecimento da pele, voltados para a remoção de rugas, flacidez e manchas, mas muitos apresentam desvantagens como a necessidade de reaplicações recorrentes, necessidade de profissionais qualificados para aplicação, riscos de contaminações e efeitos colaterais graves. Por isso, busca-se novos compostos e procedimentos que possam se tornar inovadores na área, com maior durabilidade ou maior facilidade de aplicação. Uma alternativa de origem natural poderia ser a Cramol 1,4, que apresenta a capacidade de induzir a produção de colágeno. Contudo, existe a necessidade de realização de novos testes por modelos experimentais fidedignos, como as culturas celulares, que além de apresentarem boa representatividade e segurança, está dentro das conformidades das leis vigentes.

Referências

ALBANO, R. P. S; PEREIRA, L. P.; ASSIS, I. B. Microagulhamento: a terapia que induz a produção de colágeno – revisão de literatura. Revista Saúde em Foco, n. 10, p. 455-473, 2018. Disponível em: https://portal.unisepe.com.br/unifia/wp-content/uploads/sites/10001/2018/07/058

ALBUQUERQUE, P. B. S. et al. Investigating a galactomannan gel obtained from Cassia grandis seeds as immobilizing matrix for Cramoll lectin. International Journal of Biological Macromolecules, v. 86, p. 454-461, 2016. Doi: 10.1016/j.ijbiomac.2016.01.107.

ALBUQUERQUE, P. B. S. et al. Immobilization of bioactive compounds in Cassia grandis galactomannan-based films: Influence on physicocheâncerionerties. International Journal of Biological Macromolecules, v. 96, p. 727-735, 2017. Doi: 10.1016/j.ijbiomac.2016.12.081.

ALVARENGA L. (Brasil). Risco de teratogenicidade associado ao uso de Roacutan (isotretinoína). São Paulo, 2015. Disponível em: Roacutan® (isotretinoina) – Risco de teratogenicidade associada ao uso do medicamento, Roche, 29 de outubro de 2015 — Agência Nacional de Vigilância Sanitária – Anvisa (www.gov.br)

ANDRADE, F. M. et al. Healing activities of Cramoll and xyloglucan membrane in cutaneous wounds of diabetic mice. Journal of Immunology and Regenerative Medicine, v. 13, 100045, 2021. Doi: 10.1016/j.regen.2021.100045.

BOO, Y. C. Ascorbic Acid (Vitamin C) as a Cosmeceutical to Increase Dermal Collagen for Skin Antiaging Purposes: Emerging Combination Therapies. Antioxidants, v. 11, n. 9, 1663, 2022. Doi: 10.3390/antiox11091663.

CSEKES, E.; RACKOVÁ, L. Skin Aging, Cellular Senescence and Natural Polyphenols. International Journal of Molecular Sciences, v. 22, n. 23, 12641, 2021. Doi: 10.3390/ijms222312641.

CARNEIRO, M. A. M. S. et al. Immunomodulatory and anti-infective effects of Cratylia mollis lectin (Cramoll) in a model of wound infection induced by Staphylococcus aureus. International Immunopharmacology, v. 100, 108094, 2021. Doi: 10.1016/j.intimp.2021.108094.

CUI, Y.; WANG, F.; VOORHEES, J. J.; FISHER, G. J. Rejuvenation of Aged Human Skin by Injection of Cross-linked Hyaluronic Acid. Plastic and Reconstructive Surgery, v. 147, p. 43S-49S, 2021. Doi: 10.1097/PRS.0000000000007620.

CUNHA, C. R. A. et al. Encapsulation into Stealth Liposomes Enhances the Antitumor Action of Recombinant Cratylia mollis Lectin Expressed in Escherichia coli. Frontiers in microbiology, v. 7, 1355, 2016. Doi: 10.3389/fmicb.2016.01355.

DAYAN, S. H. et al. Topical skin therapies in subjects undergoing full facial rejuvenation. Journal of Cosmetic Dermatology, v. 18, n. 3, p. 798-805, 2019. Doi: 10.1111/jocd.12977.

DIARIO OFICIAL DA UNIÃO. RESOLUÇÃO nº 58, de 24 de fevereiro de 2023. PLC 70/2014. [S. l.]: IMPRENSA NACIONAL, ano 41, p. 1-8, 1 mar. 2023. Disponível em: https://www.in.gov.br/en/web/dou/-/resolucao-n-58-de-24-de-fevereiro-de-2023-466792333?trk=public_post_comment-text

DISNER, G. R. Métodos alternativos à experimentação animal: aspectos éticos, históricos e legais no Brasil. Evidência: Biociências, Saúde e Inovação, v. 19, n. 2, p. 259-274, 2019. Doi: 10.18593/eba.v19i2.20964.

FALLAH, H.; RADEMAKER, M. Isotretinoin in the management of acne vulgaris: practical prescribing. International Journal of Dermatology, v. 60, n. 4, p. 451-460, 2021. Doi: 10.1111/ijd.15089.

GAUTAM, A. K.; SHARMA, D.; SHARMA, J.; SAINI, K. C. Legume lectins: Potential use as a diagnostics and therapeutics against the Cancer. International Journal of Biological Macromolecules, v. 142, p. 474-483, 2020. Doi: 10.1016/j.ijbiomac.2019.09.119.

GREF, R. et al. Vitamin C–squalene bioconjugate promotes epidermal thickening and collagen production in human skin. Scientific reports, v. 10, n. 1, 16883, 2020. Doi: 10.1038/s41598-020-72704-1.

HO, C. Y.; DREESEN, O. Faces of cellular senescence in skin aging. Mechanisms of Ageing and Development, v. 198, 111525, 2021. Doi: 10.1016/j.mad.2021.111525.

HUANG, Y. C.; CHENG, Y. C. Isotretinoin treatment for acne and risk of depression: A systematic review and meta-analysis. Journal of the American Academy of Dermatology, v. 76, n. 6, p. 1068-1076, 2017. Doi: 10.1016/j.jaad.2016.12.028. 

HULDANI, H. et al. Concanavalin A as a promising lectin‑based anti‑câncer agent: the molecular mechanisms and therapeutic potential. Cell Communication and Signaling, v. 20, 167, 2022. Doi: 10.1186/s12964-022-00972-7.

MELO, C. M. L. et al. Cramoll 1,4 lectin increases ROS production, calcium levels, and cytokine expression in treated spleen cells of rats. Molecular and Cellular Biochemistry, v. 342, p. 163-169, 2010. Doi: 10.1007/s11010-010-0480-z.

MELO, C. M. L. et al. Healing activity induced by Cramoll 1,4 lectin in healthy and immunocompromised mice. International Journal of Pharmaceutics, v. 408, p. 113-119, 2011. Doi: 10.1016/j.ijpharm.2011.02.011. 

MOON, S; KIM, D. H.; SHIN, J. U. In Vitro Models Mimicking Immune Response in the Skin. Yonsei Medical Journal, v. 62, n. 11, p. 969-980, 2021. Doi: 10.3349/ymj.2021.62.11.969.

MONTEIRO, M. R. et al. Cultura de fibroblastos dérmicos humanos na presença de ácido hialurônico e polietilenoglicol: efeitos na proliferação celular, produção de colágeno e enzimas relacionadas à remodelação da matriz extracelular. Surgical & Cosmetic Dermatology, v. 5, n. 3, p. 222-225, 2013.

NASCIMENTO, C. O. et al. Purification of a lectin from Cratylia mollis crude extract seed by a single step PEG/phosphate aqueous two-phase system. Preparative Biochemistry & Biotechnology, v. 50, n. 7, p. 655-663, 2020. Doi: 10.1080/10826068.2020.1725771.

NGUYEN, A. V.; SOULIKA, A. M. The Dynamics of the Skin’s Immune System. International Journal of Molecular Sciences, v. 20, n. 8, 1811, 2019. Doi: 10.3390/ijms20081811.

OLIVEIRA, P. S. S. et al. Cratylia mollis 1, 4 Lectin: A New Biotechnological Tool in IL-6, IL-17A, IL-22, and IL-23 Induction and Generation of Immunological Memory. BioMed Research International, 263968, 2013. Doi: 10.1155/2013/263968.

PEREIRA, D. S. T. et al. Topical Application Effect of the Isolectin Hydrogel (Cramoll 1,4) on Second-Degree Burns: Experimental Model. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 184538, 2012. Doi: 10.1155/2012/184538.

PORFÍRIO, E.; FANARO, G. B. Suplementação com colágeno como terapia complementar na prevenção e tratamento de osteoporose e osteoartrite: uma revisão sistemática. Revista Brasileira de Geriatria e Gerontologia, v. 19, n. 1, p. 153-164, 2016. Doi: 10.1590/1809-9823.2016.14145.

SÁ, R. A. et al. Larvicidal activity of lectins from Myracrodruon urundeuva on Aedes aegypti. Comparative Biochemistry and Physiology, v. 149, n. 3, p. 300-306, 2009. Doi: 10.1016/j.cbpc.2008.08.004.

SCARANO, A. et al. The role of hyaluronic acid and amino acid against the aging of the human skin: A clinical and histological study. Journal of Cosmetic Dermatology, v. 20, n. 7, p. 2296-2304, 2021. Doi: 10.1111/jocd.13811.

SHIN, J. W. et al. Molecular Mechanisms of Dermal Aging and Antiaging Approaches. International Journal of Molecular Science, v. 20, n. 9, 2126, 2019. Doi: 10.3390/ijms20092126.

SILVA, L. M. et al. Promising alternative gum: Extraction, characterization, and oxidation of the galactomannan of Cassia fistula. International Journal of Biological Macromolecules, v. 165, p. 436-444, 2020. Doi: 10.1016/j.ijbiomac.2020.09.164.

SUZUKI, S. et al. Inhibition of melanin production and promotion of collagen production by the extract of Kuji amber. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, v. 84, n. 3, p. 518-525, 2020. Doi: 10.1080/09168451.2019.1693251. 

TAUB, A. F.; PHAM, K. Stem cells in Dermatology and Anti-aging Care of the Skin. Facial Plastic Surgery Clinics of North America, v. 26, n. 4, p. 425-437, 2018. Doi: 10.1016/j.fsc.2018.06.004.

WILLIAMS, F. M. In vitro studies – how good are they at replacing in vivo studies for measurement of skin absorption? Environmental Toxicology and Pharmacology, v. 21, n. 2, p. 199-203, 2006. Doi: 10.1016/j.etap.2005.07.009.

WOHLRAB, J.; HILPERT, K.; WOLFF, L. Epidermal aging and anti-aging strategies. Der Hautarzt; Zeitschrift fur Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete, v. 67, n. 2, p. 107-111, 2016. Doi: 10.1007/s00105-015-3734-6.

ZOUBOULIS, C. C. et al. Aesthetic aspects of skin aging, prevention, and local treatment. Clinics in Dermatology, v. 37, n. 4, p. 365-372, 2019. Doi: 10.1016/j.clindermatol.2019.04.002.

CAPÍTULO 8

ENSAIOS METABÓLICOS IN VITRO PARA AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS

IN VITRO METABOLIC ASSAYS FOR ASSESSING MAGNETIC NANOPARTICLES TOXICITY

DOI: https://doi.org/10.56001/22.9786500466386.08

Submetido em: 04/03/2024

Revisado em: 05/03/2024

Publicado em: 05/03/2024

Karina Midori Endo

Universidade Estadual do Centro-Oeste (UNICENTRO), Guarapuava-PR

http://lattes.cnpq.br/8818925198298091

Ruan Rompato Vieira

Universidade Estadual de Maringá (UEM), Maringá-PR

http://lattes.cnpq.br/7015330658704984

Elisa Parcero Hernandes

Universidade Estadual de Maringá (UEM), Maringá-PR

http://lattes.cnpq.br/4886582059466704

Suzana de Paiva

Universidade Estadual de Maringá (UEM), Maringá-PR

http://lattes.cnpq.br/3169689625844164

Resumo

Avanços significativos da nanotecnologia que trata de materiais com dimensões da ordem de 100 nm ou menos, tem impulsionado seu crescente interesse em inúmeras áreas, incluindo medicina, farmacêutica, devido às suas potenciais aplicações em diagnóstico e terapia. Entre os nanomateriais, as nanopartículas magnéticas (NPMs) emergem como candidatas mais promissoras, caracterizadas por seu excelente comportamento superparamagnético, biocompatibilidade e fácil síntese. Assim, a identificação e compreensão aprofundadas das propriedades fisico-químicas são cruciais para prever possíveis riscos em sistemas biológicos. No contexto da nanotecnologia, inúmeros estudos foram conduzidos para avaliar os efeitos biológicos resultantes da exposição às nanopartículas. Dentre os indicadores mais relevantes para a bioavaliação in vitro, a citotoxicidade assume papel central. Portanto, este trabalho visa apresentar uma revisão dos métodos frequentemente utilizados para avaliar o potencial citotóxico in vitro das nanopartículas magnéticas. A análise desses métodos é essencial para compreender os efeitos das NPMs em linhagens celulares, proporcionando uma comprensão valiosa sobre a segurança e eficácia desses nanomateriais. Esse conhecimento é fundamental para orientar o desenvolvimento seguro e eficiente das nanopartículas magnéticas, especialmente no contexto de aplicações biomédicas.

Palavras-Chave: Nanotecnologia, Toxicidade de Nanopartículas, Citotoxicidade, Ensaios in vitro, Biocompatibilidade.

Abstract

Significant advances in nanotechnology, dealing with materials with dimensions on the order of 100 nm or less, have driven its increasing interest in numerous areas, including medicine and pharmaceuticals, due to their potential applications in diagnosis and therapy. Among nanomaterials, magnetic nanoparticles (MNPs) emerge as the most promising candidates, characterized by their excellent superparamagnetic behavior, biocompatibility, and easy synthesis. Thus, the thorough identification and understanding of physicochemical properties are crucial for predicting possible risks in biological systems. In the context of nanotechnology, numerous studies have been conducted to assess the biological effects resulting from exposure to nanoparticles. Among the most relevant indicators for in vitro bioevaluation, cytotoxicity plays a central role. This work aims to present a review of the most frequently used methods to evaluate the in vitro cytotoxic potential of magnetic nanoparticles. The analysis of these methods is essential to understand the effects of MNPs on cell lines, providing valuable insights into the safety and efficacy of these nanomaterials. This knowledge is fundamental to guide the safe and efficient development of magnetic nanoparticles, especially in the context of biomedical applications.

Keywords: Nanotechnology, nanoparticles toxicity, cytotoxicity, in vitro assays, biocompatibility.

Introdução

            Nos últimos anos, o interesse na utilização de nanopartículas magnéticas (NPMs) em aplicações biológicas ligadas à medicina e à biotecnologia têm aumentado significativamente. Um dos nanomateriais bem conhecidos são as nanopartículas de ferro e seus óxidos, como a magnetita (Fe₃O₄) e a maghemita (γ‐Fe₂O₃). As nanopartículas sintetizadas a partir desses materiais têm grande potencial nas áreas biológicas e médicas (PANKHURST et al., 2003; ABAKUMOV et al., 2018).

As aplicações das nanopartículas magnéticas de óxido de ferro estão relacionadas a ensaios clínicos como agentes de contraste em imageamento por ressonância magnética, aplicações clínicas na entrega de fármacos (ALPHANDÉRY, 2019; DADFAR et al., 2019) e magnetohipertermia na terapia do tumor (LAURENT et al., 2011). As principais características que tornam as NPMs potencialmente importantes para aplicações tecnológicas são baseadas em propriedades químicas e princípios da física, como a utilização das propriedades magnéticas das nanopartículas, por exemplo, para aquecer coloides utilizando campos magnéticos alternados (KAN-DAPAAH et al., 2014) e o direcionamento das NPMs para um local específico através de campo magnético externo (ZHAO et al., 2012; VALDIGLESIAS et al., 2016).

No entanto, a avaliação dos perigos e riscos dos nanomateriais é de extrema importância, pois ainda existem questões que devem ser avaliadas para que se façam testes e avaliações de segurança para esses materiais, principalmente dentro do que preconiza os orgãos regulatórios dos países, como, por exemplo, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA, no Brasil. Alguns pontos devem ser levantados para otimizar as avaliações de segurança dos nanomateriais, tais como: relacionar a estabilidade da dispersão de nanomateriais e a dosagem em testes de toxicidade, em particular, para parâmetros de saúde humana, desenvolver ainda mais testes ou orientações sobre a degradação e transformação de nanomateriais orgânicos ou nanomateriais com componentes orgânicos, e promover testes e orientações para medir a reatividade celular de nanomateriais. Dentro desses parâmetros, para que possamos entender melhor a reatividade celular dos materiais, podemos utilizar os estudos de citotoxicidade em modelos celulares em laboratório. Neste sentido, existem várias análises que podem contribuir para um melhor entendimento e segurança na utilização desses materiais.

Portanto, o objetivo deste trabalho é descrever as principais técnicas de atividade metabólica em cultura celular in vitro comumente empregadas para análise da toxicidade de nanopartículas magnéticas.

Metodologia

O presente estudo trata-se de uma revisão narrativa de literatura referente às principais técnicas utilizadas para avaliação da citotoxicidade in vitro. Para o levantamento do estudo, foram utilizadas as plataformas Science Direct, PubMed e Web of Science. Os trabalhos científicos foram selecionados com o emprego de símbolos de truncagem e os operadores booleanos (AND e OR), utilizando-se das seguintes palavras-chave: iron oxide nanoparticle, cytotoxicity, cell viability, superparamagnetic iron oxide nanoparticle. Baseado nelas, as combinações lógicas utilizando MeSh Terms: “Magnetic Iron Oxide Nanoparticle” AND “Cytotoxicity” OR “Cell Survival” AND “in vitro” . O termo “Cytotoxicity” para a plataforma Pubmed não se enquadra como MeSh, sendo incorporado à pesquisa os filtros Title e Abstract para a recuperação de artigos pertinentes. A partir da escolha das palavras-chave e dos portais de pesquisa, a pesquisa limitou-se aos artigos publicados no período de 1 de janeiro de 2014 a 31 de dezembro de 2024 (Figura 1).

Para critérios de inclusão, foram selecionados somente artigos científicos cujo foco principal estivesse relacionado à temática, isto é, que fornecessem estudos envolvendo nanopartículas magnéticas e sua biocompatibilidade por meio das técnicas utilizadas para avaliação da citotoxicidade in vitro utilizando bioensaios com testes metabólicos. Artigos de revisão, capítulos de livro, comunicações curtas, resumos e teses acadêmicas, foram excluídos. Após exclusão das duplicatas dos resultados que não atenderam aos critérios de inclusão, os artigos relevantes foram escolhidos pela leitura dos títulos e do resumo, contabilizando um total de 96 artigos.  Os critérios de exclusão foram artigos que não atendiam as discriminações dentro dos seus títulos e resumos, ou seja, que não expuseram de forma clara quais técnicas utilizaram, além de artigos em humanos e in vivo.

Figura 1. Etapa simplificada do processo metodológico utilizado na identificação de trabalhos nas bases de dados Science Direct, PubMed e Web of Science.

Fonte: Os autores (2024).

Resultados e Discussão

• Nanotecnologia

A nanotecnologia é uma área de pesquisa interdisciplinar e multidisciplinar devido às inúmeras aplicações potenciais em diversas áreas como medicina, química, física, engenharia, farmacêutica, agrícola, eletrônica, catálise (BROLLO et al., 2014; SHAMING; REMITA, 2015) e nas últimas décadas tem sido extensivamente introduzida em aplicações biomédicas na distribuição de fármacos, particularmente no diagnóstico de imagem e tratamento de câncer (CONDE et al., 2012). É um dos campos mais promissores e crescentes que envolve o uso de materiais e equipamentos com capacidade de manipulação das propriedades físicas e químicas de uma substância ao nível molecular. Já a biotecnologia utiliza conhecimento e técnicas de biologia na manipulação da genética, biologia celular e molecular para produtos e serviços. A fusão entre a nanotecnologia e a biotecnologia, chamada nanobiotecnologia, possibilita que tecnologias clássicas sejam fundidas com uma abordagem molecular biológica (FAKRUDDIN et al., 2012).

Novas propriedades catalíticas, elétricas, ópticas e magnéticas podem ser assumidas por objetos em nanoescala menores que 100 nm, devido ao seu tamanho reduzido e extensa área de superfície. Estas propriedades diferentes apresentadas por tais materiais, são usadas em várias aplicações biomédicas, em diversas áreas da saúde, como estudo de doenças infecciosas, cardíacas e vasculares, degenerativas, imunes, na hepatite e no câncer (LEE et al., 2012; WEBSTER et al., 2016).

A nanotecnologia é, em sua essência, a ciência relacionada à engenharia e aplicação de nanomateriais, objetos naturais ou produzidos com, no mínimo, uma das três dimensões na escala nanométrica (1–100 nm) (EUROPEAN COMMISSION, 2011). Os nanomateriais representam, sob a perspectiva biológica, plataformas multifuncionais altamente personalizáveis para o transporte não-invasivo de praticamente qualquer forma de carga biológica em um grupo celular alvo selecionado com o intuito de investigação, diagnóstico e/ou fins terapêuticos. Estudos relacionados à sua biocompatibilidade têm sido favoráveis ao longo dos anos, com múltiplos carreadores em combinação com uma ampla gama de testes celulares em mamíferos (BARKALINA et al., 2014).

O grande potencial dos nanomateriais na nanomedicina está relacionado às características que favorecem a sua utilização no campo da pesquisa, como o reduzido tamanho, semelhante a biomoléculas, integração em processos fisiológicos celulares, passagem através da membrana plasmática, transição entre os compartimentos celulares, extensa área de superfície, alta seletividade e especificidade de vias endógenas funcionais, entre outras (BARKALINA et al., 2014).

• Nanopartículas Magnéticas

As nanopartículas magnéticas (NPMs) pertencem ao grupo de nanomateriais com grande impacto em áreas como química analítica, biossensores e nanomedicina (KUDR et al., 2017). Em geral, as NPMs podem ser divididas em óxidos de metais, metais puros e nanocompostos magnéticos. As mais comumente usadas como nanovetores magnéticos para entrega de fármacos são as baseadas em ferro, cobalto e níquel (LONG et al., 2015). Embora possam conter outros elementos, eles são óxidos magnéticos, tais como, magnetita (Fe₃O₄), maghemita (γ-Fe₂O₃), hematita (α-Fe₂O₃), geotita, ferrita de cobalto (CoFe₂O₄), ferrita de níquel (NiFe₂O₄), entre outros (BUCAK et al., 2012).

Os materiais magnéticos sintetizados por estes metais têm sido relacionados em diferentes modos no desenvolvimento da tecnologia moderna e despertado atenção no que diz respeito ao diagnóstico e terapia de doenças nos últimos anos (GUL et al., 2019) devido à sua biocompatibilidade, fácil modificação de superfície, excelente estabilidade química e física, precisão de controle de sua composição e estrutura e propriedades magnéticas (GUGLIELMO et al., 2010; CÓTICA et al., 2012). As Fe₃O₄ e CoFe₂O₄ são de especial interesse em virtude de sua baixa toxicidade e fácil síntese. Além disso, apresentam comportamento superparamagnético à temperatura ambiente, preferido para usos biomédicos. O superparamagnetismo é um comportamento magnético verificado em nanopartículas ferrimagnéticas ou ferromagnéticas (BUCAK et al., 2012).

Com os avanços científicos da nanotecnologia e da biologia molecular, os nanossistemas de óxido de ferro magnético têm sido amplamente estudados na medicina (GUO et al., 2018), incluindo a formação de suspensões coloidais de nanopartículas magnéticas, denominadas ferrofluidos, as quais têm sido estudadas para aplicações de hipertermia magnética, submetidas a um campo magnético que dissipa o calor e promove o aumento da temperatura no meio circundante (ZHAO et al., 2012; VALDIGLESIAS et al., 2016). O conhecimento da forma, tamanho, carga e recobrimento das nanopartículas é de extrema importância para uma síntese eficiente, eficácia de tratamentos associados à nanopartículas, sua distribuição e internalização celulares (KRALJ et al., 2011).

• Nanopartículas Magnéticas de Óxidos de Ferro

Dentre os nanomateriais inorgânicos com grande potencial e interesse em pesquisas biomédicas, os óxidos de ferro superparamagnéticos, magnetita (Fe₃O₄) e maghemita (γ‐Fe₂O₃), são um dos nanossistemas mais utilizados na nanomedicina e na biologia (TOMBÁCZ et al., 2015). O ferro e o oxigênio combinam-se quimicamente para formar óxidos de ferro, resultando na formação de cerca de 16 óxidos de ferro (CORNELL; SCHWERTMANN, 2006). Os óxidos de ferro podem existir em diferentes composições químicas, como magnetita (Fe₃O₄) ou maghemita (γ‐Fe₂O₃), e são os materiais mais adequados para aplicações biomédicas (NOQTA et al., 2019). As Fe₃O₄ estão entre as mais eficientes e comumente empregadas em termos de bioaplicações devido à capacidade superparamagnética comparada a outras NPMs, sua biocompatibilidade (LEE et al., 2012), em especial, boa estabilidade química em condições fisiológicas, altos momentos magnéticos e baixa toxicidade, as quais são características atrativas para sua aplicação em sistemas biológicos (LI et al., 2016).

No entanto, ainda existem alguns obstáculos que necessitam ser considerados. A magnetita pode sofrer modificações em contato com sistemas biológicos, levando à sua metabolização e uso para formação de hemoglobina, fazendo com que sua permanência no organismo não seja longa. Além disso, tendem a formar naturalmente aglomerados quando dispersas em solução, e isso pode ocorrer através da floculação (pequenos agregados) ou coagulação (agregados mais densos), dependendo do tempo em que permanecem em repouso (GAO, 2009). Além disso, alguns efeitos tóxicos podem ser ocasionados devido à liberação de íons de ferro da grande área superficial das NPMs no espaço intracelular. As Fe₃O₄ podem ser degradadas por hidrólise em íons de ferro livres (Fe²⁺/Fe³⁺) que interagem com o peróxido de hidrogênio (H₂O₂) gerados pelas mitocôndrias para produzir radicais hidroxila (•OH) altamente reativos (Reação de Fenton), resultando em estresse oxidativo (HUANG et al., 2013).

Uma maneira efetiva de eliminar ou pelo menos, minimizar problemas, como a oxidação e agregação do ferro metálico, é a aplicação de alguns revestimentos para torná-las biocompatíveis.

• Estudos de Toxicidade

A Nanotecnologia está em constante expansão e tem apresentado consideráveis avanços no campo biomédico, sendo as nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas de especial interesse em aplicações, como no desenvolvimento e entrega de fármacos, devido às suas propriedades físicas e químicas únicas (VALDIGLESIAS et al., 2016). Os ensaios de toxicidade podem ser desenvolvidos por meio de estudos in vitro, in vivo e estudos nanotoxicológicos clínicos. Os testes in vitro são considerados pontos de partida para toxicidade das NPMs, pois produzem resultados confiáveis e reprodutíveis sem a utilização de animais. Além disso, são de natureza simples, barata e rápida, embora não substituam os estudos clínicos ou in vivo (PATIL et al., 2015).

Embora as NPMs tenham sido consideradas biocompatíveis, principalmente baseados em resultados de testes de viabilidade, fatores como o recobrimento, tamanho, tempo de tratamento ou tipo celular, tem influência na toxicidade (VALDIGLESIAS et al., 2016). Inúmeros estudos de toxicidade destas NPMs têm sido feitos com elas sem uma cobertura na superfície e com várias coberturas diferentes (REVIA; ZHANG, 2016).

• Citotoxicidade

A citotoxicidade é considerada o perfil toxicológico mais frequentemente investigado das nanopartículas magnéticas. Caracteriza-se principalmente como o potencial de um composto para induzir a morte celular. As células respondem rapidamente ao estresse tóxico alterando as taxas metabólicas, o crescimento celular ou a transcrição genética para controlar suas funções celulares básicas. Desta forma, testes de citotoxicidade in vitro são úteis e necessários para definir a capacidade intrínseca de um composto para provocar a morte de células como consequência dos danos nas funções celulares básicas. Testes de citotoxicidade também são necessários para definir a faixa de concentração a ser testada com relação aos parâmetros de genotoxicidade, mutagenicidade ou morte celular programada (EISENBRAND et al., 2002).

Os diferentes efeitos celulares após a exposição às NPMs em estudos in vitro são dependentes da concentração de íons, tempo de exposição, tipo celular avaliado, o tamanho, forma, carga, área de superfície, agregação, presença e tipo de revestimento das NPMs têm um impacto significativo nos estudos in vitro de toxicidade (PATIL et al., 2015; VALDIGLESIAS et al., 2016).

Inúmeras linhagens celulares e diferentes condições de teste são avaliadas e os efeitos celulares relatados são principalmente redução da viabilidade, produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e liberação de íons de ferro, além de indução de apoptose, alterações do ciclo celular, comprometimento da membrana celular, modificações do citoesqueleto, entre outros (SOENEN; DE CUYPER, 2010). No entanto, inúmeros estudos relatando o potencial de citotoxicidade mostram que as NPMs não possuem ou apresentam reduzido efeito citotóxico. Os ensaios de citotoxicidade geralmente representam testes preliminaries e são divididos principalmente em ensaios metabólicos e de integridade de membrana.

Com base no levantamento da pesquisa, foram obtidos os seguintes resultados mostrados no gráfico abaixo dos trabalhos envolvendo a atividade metabólica em modelos celulares in vitro mais empregadas para análise da toxicidade de nanopartículas magnéticas (Figura 2). A grande maioria dos trabalhos envolveu avaliações da citotoxicidade das NPMs utilizando o ensaio do MTT (77,1%). Outros trabalhos utilizaram ROS (14,6%), Resazurina (4,2%), Vermelho Neutro (2,1%), MFT (1,0%) e Azul de Prússia (1,0%).

Figura 2. Representação das técnicas utilizadas nos artigos encontrados nas bases de dados Science Direct, PubMed e Web of Science.

Fonte: Os autores (2024).

• Ensaio do MTT

Os ensaios metabólicos são amplamente aplicados, em geral, com ênfase no metabolismo mitocondrial. Uma redução da atividade metabólica celular é geralmente aceita como um indicador precoce de dano celular (RODRIGUES et al., 2012). O ensaio de citotoxicidade mais comum é o teste quantitativo in vitro denominado de ensaio do MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazólio), desenvolvido por Mosmann em 1983. Este método baseia-se na capacidade da succinato desidrogenase, uma enzima do ciclo de Krebs, ativa em mitocôndrias de células vivas, em converter o sal tetrazólio (MTT), que é hidrossolúvel e de cor amarelada, em cristais de formazan, de coloração roxa. Esses cristais são solubilizados pelo dimetil sulfóxido (DMSO), permitindo o cálculo da absorbância por espectrofotometria.

Collier e Pritsos (2003) indicaram que os processos oxidativos, bem como outras cadeias mitocondriais enzimáticas de elétrons, possam ser responsáveis pela metabolização do MTT. Embora a redução do MTT seja geralmente atribuída à atividade da cadeia respiratória mitocondrial, ela também tem sido relacionada com as enzimas não mitocondriais, presentes no citoplasma ou em outros compartimentos citoplasmáticos (BERNAS; DOBRUCKI, 2002). A clivagem do MTT tem várias propriedades desejáveis para avaliar a sobrevivência e proliferação, pois este pode ser clivado por todos os seres vivos, em células metabolicamente ativas, mas não por células mortas. Além disso, a quantidade de formazan gerada é diretamente proporcional ao número de células vivas, utilizando uma população de células homogêneas (MOSMANN, 1983). Portanto, somente células vivas conseguem fazer essa conversão, indicando atividade mitocondrial e consequentemente, a viabilidade celular (COLLIER; PRITSOS, 2003). Assim, as vantagens deste ensaio colorimétrico que pode ser utilizado para avaliar a citotoxicidade, a proliferação ou a ativação celular, são a sua rapidez e precisão, e o fato de não utilizar radiação (MOSMANN, 1983). No entanto, os resultados in vitro do ensaio do MTT podem ser afetados pela grande área de superfície e a natureza química das NPMs. Portanto, a caracterização físico-química das NPMs é fundamental na análise nos estudos de toxicidade (PATIL et al., 2015).

• Ensaio do Vermelho Neutro

O ensaio do vermelho neutro (VN) (2-amino-3-metil-7dimetil-amino-cloreto de fenazina) avalia a integridade da membrana lisossomal. Este ensaio de citotoxicidade é amplamente utilizado para aplicações biomédicas e ambientais. O princípio é a de que células vivas são capazes de capturar o corante, armazenando-o nos lisossomos (MONTEIRO-RIVIERE et al., 2009).

O VN é um corante catiônico fraco que penetra nas membranas celulares pelo mecanismo de difusão passiva não iônica e concentra-se nos lisossomos (PATIL et al., 2018). O corante liga-se à matriz lisossomal por interação eletrostática, a qual é então, extraída das células viáveis usando uma solução de etanol acidificada, e a absorbância do corante solubilizado é quantificada usando um espectrofotômetro (FAUTZ et al., 1991). Portanto, os lisossomos em células não viáveis são capazes de reter o corante por períodos mais prolongados, enquanto uma desestabilização da membrana lisossômica resulta em extravasamento do VN ao citosol, reduzindo a quantidade de corante retida nas células (ZHAO et al., 2011).

• Ensaio de Resazurina (Alamar Azul)

O ensaio de Alamar Azul (AB), também conhecido como ensaio de resazurina, é uma técnica usada para avaliar a viabilidade celular e a citotoxicidade em experimentos biológicos. Este ensaio é frequentemente utilizado para medir a resposta de células a diferentes condições de tratamento, como exposição a compostos químicos, fármacos ou nanopartículas. O ensaio é muito parecido com a metodologia empregada no MTT, porém, baseado na capacidade das células metabolicamente ativas de converter o corante azul não fluorescente, resazurina, em resorufina, um composto fluorescente. As células são tratadas conforme o protocolo experimental. Após o período de exposição, as células são lavadas para remover quaisquer partículas ou substâncias não internalizadas e, em seguida, é adicionada a resazurina.

No entanto as células metabolicamente ativas convertem a resazurina em resorufina, um composto fluorescente. Este processo tem a capacidade de mostrar ou indicar a viabilidade celular. A fluorescência é medida usando um leitor de placas. Um aumento na fluorescência indica maior viabilidade celular, enquanto uma diminuição pode sugerir citotoxicidade ou redução na atividade cellular (PAGE; PAGE; NOEL, 1993).

Por fim, de modo geral, com base nos estudos obtidos das plataformas citadas, foram avaliadas as limitações dos métodos de ensaio e o MTT mostrou interferência com a conversão do corante em cristais de formazan quando testado com inibidores da glicólise, enquanto nenhuma interferência foi observada nos ensaios de captura de vermelho neutro (VN), redução de resazurina (RES) e sulforodamina B (SRB). Esta observação indica que os inibidores da glicólise podem distorcer os resultados do ensaio MTT, alterando a capacidade das células de metabolizar o corante MTT em formazan, levando a uma avaliação imprecisa da viabilidade celular. Por outro lado, os ensaios de VN, RES e SRB não foram afetados pela presença de inibidores da glicólise. Isso pode ser atribuído a diferentes mecanismos de ação e metabólitos associados a esses ensaios.

Portanto, ao selecionar um ensaio para avaliar a viabilidade celular em experimentos que envolvem inibidores da glicólise, é importante considerar a susceptibilidade do ensaio à interferência dessa via metabólica específica (STOCKERT et al., 2018; VAN TONDER; JOUBERT; CROMARTY, 2015).

Considerações Finais

Nanopartículas de óxido de ferro têm potencial em inúmeras aplicações biomédicas. No entanto, as formulações devem ser testadas para garantir a biocompatibilidade das NPMs e prever o mecanismo de ação em sistemas biológicos. Testes de citotoxicidade são considerados o perfil toxicológico amplamente investigados e ponto de partida para estudos com estes nanomateriais. Um amplo espectro de ensaios é utilizado atualmente em modelos celulares expostos às NPMs. O ensaio MTT se mostrou a técnica mais estudada nos artigos, porém, deve-se destacar que o mesmo pode apresentar limitações, das quais precisam ser consideradas quando o pesquisador executar seus testes com células.

A definição do melhor método de ensaio é crucial para avaliar os tipos de interação. A interferência do composto do teste pode alterar a interpretação, e deste modo, afetar os resultados. Assim, os métodos descritos devem ser escolhidos baseados nas características das NPMs e nas aplicações pretendidas. Portanto, quando se aborda a segurança dessas NPMs, os métodos de estudo devem ser reavaliados no estabelecimento de novas terapias e que possibilitem extrair todas as propriedades benéficas que esses nanomateriais possam oferecem para aplicações médicas.

Agradecimentos

Os autores agradecem a CAPES/Brasil pela bolsa concedida.

Referências

BARKALINA, N. et al. Nanotechnology in reproductive medicine: emerging applications of nanomaterials. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, v. 10, n. 5, p. e921-e938, 2014.

BERNAS, T.; DOBRUCKI, J. Mitochondrial and nonmitochondrial reduction of MTT: interaction of MTT with TMRE, JC-1, and NAO mitochondrial fluorescent probes. Cytometry, v. 47, p. 236-42, 2002.

BROLLO, M. E. F. et al. Compact Ag@ Fe₃O₄ Core-shell Nanoparticles by Means of Single-step Thermal Decomposition Reaction. Scientific Reports, v. 4, 2014.

BUCAK, S.; SEZER, A. D.; YAVUZTÜRK, B. Magnetic nanoparticles: synthesis, surface modifications and application in drug delivery. INTECH Open Access Publisher, 2012.

COLLIER, A. C.; PRITSOS, C. A. The mitochondrial uncouple dicumarol disrupts the MTT assay. Biochemistry & Pharmacy, v. 66, n. 2, p. 281-287, 2003.

CONDE, J.; DORIA, G.; BAPTISTA, P. Noble metal nanoparticles applications in cancer. Journal of Drug Delivery, v. 2012, 751075, 2012.

CÓTICA, L. F. et al. Simple and facile approach to synthesize magnetite nanoparticles and assessment of their effects on blood cells. Journal of Magnetism and Magnetic Materials, v. 324, n. 4, p.559-563, 2012.

EISENBRAND, G. et al. Methods of in vitro toxicology. Food and Chemical Toxicology, v. 40, n. 2-3, p. 193-236, 2002.

EUROPEAN COMMISION (EC). Commission recommendation of 18 October 2011 on the definition of nanomaterial. Official Journal of the European Union (OJEU). 275/38-75/40. 2011. Disponível em: <https://ec.europa.eu/research/industrial_technologies/pdf/policy/commission-encommendation-on-the-definition-of-nanomater-18102011_en.pdf>. Acesso jul. 2023.

FAKRUDDIN, M. D.; HOSSAIN, Z.; AFROZ, H. Prospects and applications of nanobiotechnology: a medical perspective. Journal of Nanobiotechnology, v. 10, n. 31, 2012.

FAUTZ, R.; HUSEIN, B.; HECHENBERGER, C. Application of the neutral red assay (NR assay) to monolayer cultures of primary hepatocytes: rapid colorimetric viability determination for the unscheduled DNA synthesis test (UDS). Mutation Research., v. 253, p. 173-179, 1991.

GAO, J.; XU, B. Applications of nanomaterials inside cells. Nano Today, v. 4, n. 1, p. 37-51, 2009.

GUGLIELMO, C. D. et al. Embryotoxicity of cobalt ferrite and gold nanoparticles: A first in vitro approach. Reproductive Toxicology, v. 30, p. 271-276, 2010.

GUO, T. et al. The recent advances of magnetic nanoparticles in medicine. Journal of Nanomaterials, v. 2018, 2018.

HUANG, G. et al. Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles: Amplifying ROS Stress to Improve Anticancer Drug Efficacy. Theranostics, v. 3, p. 116-126, 2013.

KRALJ, S.; DROFENIK, M.; MAKOVEC, D. Controlled surface functionalization of silica-coated magnetic nanoparticles with terminal amino and carboxyl groups. Journal of Nanoparticle Research, v. 13, n. 7, p. 2829-2841, 2011.

LEE, A. V.; OESTERREICH, S.; DAVIDSON, N. E. MCF-7 cells – Changing the course of breast cancer research and care for 45 years. Journal of the National Cancer Institute, v. 107, n. 7, 2015.

LEE, D. et al. Multifunctional nanoparticles for multimodal imaging and theragnosis. The Royal Society of Chemistry, v.41, p. 2656-2672, 2012.

LI, G. et al. Rapamycin loaded Fe₃O₄/carboxymethylchitosan nanoparticles as tumor-targeted drug delivery system: Synthesis and in vitro characterization. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 128, p. 379-388, 2016.

KAN-DAPAAH, K.; RAHBAR, N.; SOBOYEJO, W. Implantable magnetic nanocomposites for the localized treatment of breast cancer. Journal of Applied Physics, v.116, 2014.

KUDR, J. et al. Magnetic nanoparticles: From design and synthesis to real world applications. Nanomaterials, v. 7, n. 9, p. 243, 2017.

LONG, N. V. et al. Biomedical applications of advanced multifunctional magnetic nanoparticles. Journal of nanoscience and nanotechnology, v. 15, n. 12, p. 10091-107, 2015.

MONTEIRO-RIVIERE, N. A.; INMAN, A. O.; ZHANG, L. W. Limitations and relative utility of screening assays to assess engineered nanoparticle toxicity in a human cell line. Toxicology and Applied Pharmacology, v. 234, n. 2, p. 222-235. 2009.

MOSMANN, T. Rapid Colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods, v. 65, n. 1-2, p. 55-63, 1983.

NOQTA, O. A. et al. Recent Advances in Iron Oxide Nanoparticles (IONPs): Synthesis and Surface Modification for Biomedical Applications. Journal of Superconductivity and Novel Magnetism, v. 32, p. 779-795, 2019.

PAGE, B.; PAGE, M.; NOEL, C. A new fluorometric assay for cytotoxicity measurements in-vitro. International Journal of Oncology, v. 3, n. 3, p. 473-476, 1993.

PATIL, R. M. et al. Comprehensive cytotoxicity studies of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Biochemistry and Biophysics Reports, v. 13, p. 63-72, 2018.

PATIL, U. S. et al. In Vitro/In Vivo Toxicity Evaluation and Quantification of Iron Oxide Nanoparticles. International Journal of Molecular Sciences, v. 16, n. 10, p. 24417-50, 2015.

REVIA, R. A.; ZHANG, M. Magnetite nanoparticles for cancer diagnosis, treatment, and treatment monitoring: recent advances. Mater Today (Kidlington), v. 19, n. 3, p. 157-168, 2016.

RODRIGUES, S. et al. Biocompatibility of Chitosan Carriers with Application in Drug Delivery. Journal of Functional Biomaterials., v. 3, n. 3, p. 615-41, 2012.

SHAMING, D.; REMITA, H. Nanotechnology: from the ancient time to nowadays. Foundations of Chemistry, v. 17, n. 3, p. 187-205, 2015.

SOENEN, S. J., DE CUYPER, M. Assessing iron oxide nanoparticle toxicity in vitro: current status and future prospects. Nanomedicine, v. 5, n. 8, p. 1261-1275, 2010.

STOCKERT, J. C. et al. Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives. Acta Histochemica, v. 120, n. 3, p. 159-167, 2018.

TOMBÁCZ, E. et al. Magnetic iron oxide nanoparticles: Recent trends in design and synthesis of magnetoresponsive nanosystems. Biochemical and biophysical research communications, v. 468, n. 3, p. 442-453. 2015.

VALDIGLESIAS, V. et al. Are iron oxide nanoparticles safe? Current knowledge and future perspectives. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, v. 38, p. 53-63, 2016.

VAN TONDER, A.; JOUBERT, A. M.; CROMARTY, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes, v. 8, n. 1, p. 47, 2015.

WEBSTER, C. A. et al. An early developmental vertebrate model for nanomaterial safety: bridging cell-based and mammalian toxicity assesment. Nanomedicine (Lond.), v. 6, p. 643-656, 2016.

ZHAO, Z. et al. Magnetite nanoparticles as smart carreira to manipulasse the cytotoxicity of anticancer drugs: magnetic control and pH-responsive release. Journal of Materials Chemistry, v. 22, p. 15717-15725, 2012.